우리는 공기 액체 인터페이스 (ALI)에서 경작 된 인간 폐 세포를 노출시킴으로써 급성 폐 세포 독성에 관한 공기 중 입자의 스크리닝 및 모니터링을위한 견고하고 양도 가능하며 예측 가능한 체외 노출 시스템을 제시합니다.
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이 논문에서
요약
초록
여기에서, 우리는 ALI에서 재배된 인간 폐 세포의 균질한 노출을 가스, 입자 또는 복잡한 대기(예: 담배 연기)에 균질하게 노출할 수 있도록 특별히 설계된 시험관 내 노출 시스템을 제시하여 현실적인 생리학적 인 생리학적 을 제공합니다. 공기에 인간 폐포 영역의 정점 표면의 노출. 선형 에어로졸 가이던스가 있는 순차적 노광 모델과 는 달리, 방사형 유량 계통의 모듈식 설계는 테스트 분위기의 연속 생성 및 세포 수송, 균질한 분포 및 증착에 대한 모든 요구 사항을 충족합니다. 입자와 대기의 지속적인 제거. 이 노출 방법은 주로 공기 중 입자에 세포의 노출을 위해 설계, 하지만 에어로졸 생성 방법 및 노출 모듈의 재료에 따라 액체 에어로졸 및 매우 독성및 공격적인 가스의 노출에 적응 될 수있다 .
최근 완료된 검증 연구의 틀 안에서, 이 노출 시스템은 공기 중 입자의 급성 폐 세포 독성의 질적 평가를 위한 양도 가능, 재현 가능 및 예측 스크리닝 방법으로 입증되었으며, 이에 따라 잠재적으로 감소 또는 일반적으로이 독성 평가를 제공 하는 동물 실험을 대체.
서론
유독한 공기 중 입자의 흡입은 공중 위생 관심사, 전 세계적으로 건강 위험의 다수로 이끌어 내고 죽음의 많은 수백만 매년1,2. 기후변화, 지속적인 산업발전, 에너지, 농산물 및 소비재에 대한 수요 증가는 지난 몇 년간폐질환의증가에 기여해 왔으며3, 4,5,6. 그들의 급성 흡입 독성에 관한 흡입 성 물질의 지식과 평가는 위험 평가 및 위험 관리의 기초를 제공하지만,이 정보는 여전히 이러한 물질의 넓은 범위에 대한 부족7,8. 2006년부터 EU 화학 법규 REACH(화학물질등록, 평가, 승인 및 제한)는 기존 및 새로 도입된 제품이 시장에 출시되기 전에 흡입 경로를 포함한 독성 특성화를 거쳐야 합니다. 따라서 REACH는 대체 및 동물 없는 방법, "3R" 원리의 구현(동물 실험의 대체, 정제 및 감소) 및 적절한 시험관 내 모델의 사용에 초점을 맞추고
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프로토콜
참고: 한 노출 실험의 프로토콜은 3일의 기간을 다룹니다.
1일차
1. 세포의 일반적인 준비 및 재배
참고: 인간 폐 선암상피 세포주 A549를 노출 실험에 사용하였다. 세포는 멸균 조건하에서 처리되어야 합니다. ALI에서 의 재배에 적합한 다른 세포주를 사용할 수 있다.
- 성장 배지(덜베코의 최소 필수 배지(DMEM)를 준비하고, 10% 태아 소 혈청(FBS) 및 5 μg/mL 젠타마이신을 보충하고 노출 배지(DMEM, 5 μg/mL 젠타마이신 및 최종 HEPES 농도 100 mM)를 보충합니다.
- 배양 A549 세포는 37°C에서 성장 배지에서 5%CO2를함유하는 가습된 대기에서.
- 세포 배양 플라스크에서 세포를 75 cm2(T-75)의 성장 배지의 14 mL에서 80-90%의 합류전까지(매 2-3일마다) 및 35의 대강구를 배양한다.
- 현탁액 부피 및 필요한 수의 세포 배양 인서츠(깨끗한 공기 및 입자 노출을 위한 인큐베이터 제어 및 세포 배양 삽입물로서 3개의 세포 배양 삽입물) 및 세포 배양 플레이트를 계산합니다.
- ....
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결과
CULTEX RFS는 ALI에서 세포의 직접적이고 균일한 노출을 가능하게 하는 특별히 설계된 시험관 내 노출 시스템입니다. 이전 사전 검증 연구 내에서, 이 노출 시스템의 일반적인 적용 가능성과 그 전이성, 안정성 및 재현성이 성공적으로 입증되었다. 독일 연방 교육 연구부의 지원을 받은 최근 연구 프로젝트에서 노출 시스템은 테스트된 화합물의 급성 흡입 위험에 대한 예측 모델(PM)으로 성공적으로 검증및 확립되었습니다. 사전 검증 연구 에서 청정 공기 제어의 품질이 중요한 매개 변수로 밝혀짐에 따라, 여러 프로토콜 및 방법 최적화 (예를 들어, 세포 배양 삽입물의 변화, HEPES 농도를 100 mM로 증가시킴으로써 노출 매체의 pH의 안정화)가 구현되어 검증 연구의 초기에 구현되어 매우 안정적이고 재현 가능한 결과및 3가지 청정 공기 비량성(4)을 통해 실질적인 개선으로 이어졌습니다. A549 세포는 3개의 독립적인 .......
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토론
많은 비동물 흡입 독성 시험 모델은 흡입 가능한 입자의 급성 흡입 위험에 대한 정보를 얻고 3R 원리25에따라 동물 실험을 감소 및 대체하기 위해 최근에 개발되었다.
세포 배양 모델의 관점에서, 세포의 노출은 침수 된 조건 또는 ALI에서 수행 될 수있다. 침수 된 조건 하에서 세포를 노출하는 것은 물리 화학적 특성에 영향을 미칠 수 있으며, 따라서, 시험 물질(12)의독성 특성. 그러나 시험관 내 ALI 흡입 모델은 침수된 노출보다 생물학적 및 생리적 유사성이 높은 인간 노출 상황을 모방하므로 공기 중 입자의 급성 흡입 독성을 분석하는 데 더 적합합니다. 다른 기존 노출 모듈과 관련하여 CULTEX RFS의 중요성은 ALI 조건 하에서 세포의 노출뿐만 아니라 입자의 매우 균일한 분포 및 침착입니다. 선형 에어로졸 가이던스를 이용한 순차적 노광 모델과는 달리, 이러한 노광 방법의 모듈식 설계는 .......
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공개 사항
저자 AT, KG, AB, SH, HM, TG, HT 및 DS는 공개 할 것이 없습니다. 회사 컬렉스 기술 GmbH (이전 컬텍스 연구소 GmbH) 악기를 생산 (예를 들어, CULTEX RFS, CULTEX DG) 이 문서에서 사용되는. NM은 이 연구 기간 동안 컬텍스 연구소 GmbH의 직원이었습니다. OK는 컬텍스 테크놀로지 GmbH(구 컬텍스 연구소 GmbH)의 직원입니다. 장치에 대한 특허 PCT / EP2009 / 007054는 컬트 기술 GmbH 교수 울리히 모어 (이전 컬트 연구소 GmbH)의 설립자에 의해 개최된다.
감사의 글
이 작품은 독일 연방 교육 연구부 (분데스 장관 퓌르 빌둥 und Forschung, BMBF, 독일 (그랜트 031A581, 하위 프로젝트 A-D))와 독일 연구 재단 (도이치 포슈슈젤샤프트, DFG) 지원되었다, 연구 훈련 그룹 GRK 2338).
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Cells | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | |
| 세포 배양 배지 및 용품 | |||
| DMEM | Biochrom, Berlin, Germany | FG 0415 | 성장 배지로 사용 |
| DMEM | Gibco-Invitrogen, 다름슈타트, 독일 | 22320 | 배지로 사용 |
| FBS superior | Biochrom, Berlin, Germany | S 0615 | |
| Gentamycin (10mg/mL) | Biochrom, Berlin, Germany | A 2710 | |
| HEPES 1M | Th. Geyer, Renningen, Germany | L 0180 | |
| PBS | Biochrom, Berlin, Germany | L 1825 | |
| Trypsin/EDTA (0.05%/0.02%) | Biochrom, Berlin, Germany | L 2143 | |
| Cell culture material | |||
| CASY Cups | Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Germany | REF 05651794 | |
| Cell culture plates | Corning, Wiesbaden, Germany | 3516 | 6-well plates |
| Corning Transwell cell culture inserts | Corning, Wiesbaden, Germany | 3450 | 24mm inserts; 6- 우물 플레이트; 0.4 & 마이크로; m |
| Chemicals | |||
| CASYton | Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Germany | REF 05651808001 | |
| Compressed Air (DIN EN 12021) | Linde Gas Therapeutics GmbH, Oberschleiß heim, 독일 | 2290152 | |
| WST-1 | Abcam, Cambridge, United Kingdom | ab155902 | |
| Instruments + equipment | |||
| CASY Cell Counter | Schä rfe System GmbH, 독일 로이틀링겐 | ||
| 순환 온도 조절기 | LAUDA, Lauda-Kö nigshofen, 독일 | Ecoline RE 100 | |
| CULTEX HyP - 유압 프레스 | Cultex® Technology GmbH, 하노버, 게마니 | ||
| CULTEX 인서트 슬리브 | Cultex® Technology GmbH, 하노버, 게마니 | ||
| CULTEX RFS - 방사형 유량 시스템 유형 2 (입자 노출용 모듈) | Cultex® Technology GmbH, 하노버, 게마니 | ||
| CULTEX RFS - 방사형 유량 시스템 유형 2(청정 공기 노출용 모듈) | Cultex® Technology GmbH, 하노버, 게마니 | ||
| CULTEX 공급 | |||
| 유량 컨트롤러 0-30 ml/min (IQ-Flow) | Bronkhorst Deutschland Nord GmbH | ||
| 유량 컨트롤러 0-1,5 l/min (EL-Flow) | Bronkhorst Deutschland Nord GmbH | ||
| 필터 (대) | Munktell & Filtrak GmbH, Sachsen, Germany | LP-050 | Munktell 멸균 필터; 입자 보유 효율 > 99,999% |
| 필터(소형) | Parker Hannifin Corporation, Mainz, Germany | 9933-05-DQ | Balston 일회용 필터 |
| 중간 펌프 | Cole-Parmer GmbH, Wertheim, Germany | Ismatec IPC 고정밀 다중 채널 디스펜서 | 디지털 연동 펌프 |
| Microplate Reader Infinite M200 Pro | Tecan Deutschland GmbH, Crailsheim, Germany | ||
| Vakuum 펌프 | KNF, 프라이부르크, 독일 | N86 KT.18 | |
| Vö gtlin 질량 유량 컨트롤러 0,2-10 l/min | TrigasFI GmbH | Vö gtlin red-y 소형 레귤레이터, Typ-Nr.: GCR-C3SA-BA20 | |
| 수조 | LAUDA, Lauda-Kö nigshofen, 독일 | 에코라인 스타에디션 RE 104 |
참고문헌
- Faber, S. C., McCullough, S. D. Through the Looking Glass: In vitro Models for Inhalation Toxicology and Interindividual Variability in the Airway. Applied In vitro Toxicology. 4 (2), 115-128 (2018).
- Ambient air pollution: a global assessment of exposure and burden of disease. , World Health Organization. http://apps.who.int/iris/bitstream/handle/10665/250141/9789241511353-eng.pdf?sequence=1 ....
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재인쇄 및 허가
