空気-液体界面で培養したヒト肺細胞を曝露した空気中粒子の急性吸入毒性の評価
Summary
我々は、空気-液体界面(ALI)で培養されたヒト肺細胞を暴露することにより、急性肺細胞傷害性に関する空気中の粒子のスクリーニングおよびモニタリングのための堅牢で移動可能で予測可能なインビトロ曝露システムを提示する。
Abstract
ここでは、アリで培養されたヒト肺細胞をガス、粒子、または複雑な雰囲気(例えば、タバコの煙)に均質に暴露することを可能にする特別に設計されたモジュラーインビトロ露光システムを提示し、現実的な生理学的な結果を提供する人間の肺胞領域の尖面表面の空気への暴露。線形エアロゾルガイダンスを用いた逐次露光モデルとは対照的に、ラジアルフローシステムのモジュラー設計は、試験雰囲気を細胞に連続的に生成し、輸送するためのすべての要件を満たし、均質な分布および堆積粒子と大気の連続的な除去。この露光方法は、主に空気中の粒子への細胞の暴露のために設計されていますが、エアロゾル生成方法と露光モジュールの材料に応じて、液体エアロゾルおよび高毒性および積極的なガスの暴露に適応することができます.
最近完了した検証研究の枠組みの中で、この暴露システムは、空気中の粒子の急性肺細胞毒性の定性的評価のための移動可能で再現性および予測スクリーニング方法として証明された、通常、この毒物学的評価を提供する動物実験を減らすか、置き換える可能性がある。
Introduction
有毒な空中粒子の吸入は公衆衛生上の懸念であり、世界中で多数の健康上のリスクをもたらし、毎年何百万人もの死者が年間1,2.気候変動、現在進行中の産業発展、エネルギー、農業、消費者製品の需要の高まりは、過去数年間で肺疾患の増加に貢献しています3,4,5,6.急性吸入毒性に関する吸入可能物質の知識と評価は、危険評価とリスク管理の基礎を提供するが、この情報は、これらの物質7、8の広い範囲にはまだ欠けている。2006年以来、EUの化学法学REACH(化学物質の登録、評価、認可および制限)は、市場に投入される前に、既に既存および新たに導入された製品が吸入経路を含む毒物学的特性を受けることを要求する。したがって、REACHは、代替および動物フリーの方法、”3R”原理の実施(動物実験の交換、改良、および低減)および適切なin vitroモデル9の使用に焦点を当てています。近年、空気中の粒子5,7,10,11の急性吸入毒性を評価するために、多くの異なる、十分な非動物吸入毒性試験モデル(例えば、インビトロ細胞培養、肺オンチップモデル、精密切断肺スライス(PCLS))が開発されている。in vitro細胞培養モデルの観点から、培養された細胞は、水没条件下またはALI(図1)で暴露することができる。しかし、水没した暴露試験の妥当性は、空気中の化合物、特に粒子の毒性の評価に関して限定される。水没暴露技術は、ヒト生体内の状況に対応していない。細胞を覆う細胞培養培地は、物理化学的性質に影響を及ぼし、従って、被験物質12、13の毒性特性に影響を及ぼす可能性がある。ALIインビトロ吸入モデルは、細胞培養培地を被験粒子と干渉することなく、細胞を被験物質に直接曝露することができ、従って、水没暴露12、14よりも高い生理学的および生物学的類似性を有するヒト暴露を模倣する。
REACHなどの規制プロセスに関しては、しかし、動物モデルのみが急性吸入毒物学の分野で利用可能であり、現外法は十分に検証されておらず、公式に受け入れられなくなったため、これまでに14。この目的のために、テストモデルは、試験の有効性に関する動物実験代替のための欧州連合参照研究所(EURL-ECVAM)の原則に従って検証されなければならない。
以前の検証前調査と最近完了した検証調査は、CULTEX RFS露光システムの適用領域とその転写性、安定性、再現性13を実証した。この露光システムは、細胞16上の連続的な流れにおける放射状エアロゾル分布概念および試験エアロゾルの伝導により、ALIでのガス、粒子または複雑な雰囲気(例えば、タバコの煙)への細胞の均質な暴露を可能にするインビトロ細胞ベースの露光システムである。このラジアルフローシステムの基本モジュールは、インレットアダプタ、ラジアルエアロゾル分布を備えたエアロゾルガイドモジュール、サンプリングおよびソケットモジュール、ハンドホイール付きロックモジュール(図2)で構成されています。生成された粒子は、インレットアダプタおよびエアロゾル誘導モジュールを介して細胞に到達し、サンプリングモジュールの3つの放射状に配置された露光室に位置する細胞培養インサートに堆積される。エアロゾルガイドモジュールとサンプリングモジュールは、外部の水浴17に接続することによって加熱することができます。
両方の研究の枠組みの中で、A549細胞はすべての暴露実験に使用された。細胞株A549は、ヒト不死化上皮細胞株であり、非常によく特徴付けられるものであり、多数の毒物学的研究においてII型肺胞上皮細胞のインビトロモデルとして使用されている。細胞は、ラメラ体、界面活性剤の産生および炎症関連因子の数18によって特徴付けられる。彼らはまた、その粘液産生19に起因する気管支上皮細胞の特性を示す。さらに、彼らはALIで培養することができます。この細胞株は細胞間接触を構築する上で欠乏しているが、これらの細胞の培養ははるかに便利であり、コストが安く、それに由来する結果は一次細胞20に比べてドナー非依存である。
A549細胞を6ウェル細胞培養インサート(PET膜、4.67cm2、孔径0.4mm)で、インサートあたり3.0 x105細胞の密度で播種し、水没した状態で24時間培養した。その後、3つの独立した実験室で細胞を曝露し、ALIで20の試験物質の清浄な空気および3つの異なる暴露用量(25、50、および100 μg/cm2)を行った。露光量は、15、30、または60分後に細胞上に25 μg/cm 2、50μg/cm2、100 μg/cm2の一定の粒子速度をもたらす沈着時間に相関する。しかし、堆積粒子は、堆積後は洗い流されず、24時間細胞上に残った。したがって、粒子の堆積時間は15、30、60分であったが、細胞の暴露は合計で24時間続いた。試験物質の沈着速度は、前の方法17に従った予備実験で決定した。
毒性の指標としての細胞生存率は、細胞生存率アッセイを用いて粒子沈着後24時間評価した。特に、クリーンエアコントロールの品質、露出プロトコルの最適化と改良、実験室内再現性、予測モデル(PM)の確立に特に焦点を当てました。細胞生存率が50%以下に低下した物質(PM 50%)または75%(午後75%)3つの曝露用量のいずれかで、急性吸入の危険を及ぼすと考えられた。その後、既存のin vivoデータ(OECDテストガイドライン(TG)403またはTG 43621、22に従った少なくとも1つの信頼性の高い研究に基づいて、83%の特異性と88%23の感度を有する85%の全体的な一致性に導いた。
細胞生存率の測定に加えて、サイトカイン放出、LDHアッセイによる細胞ライセートまたは膜完全性の検査などの他のエンドポイントは評価できるが、検証試験には必要ではなかった。したがって、露光システム(例えば、CULTEX RFS)は、試験された空気中粒子の急性吸入毒性の定性評価のための予測スクリーニングシステムとして証明され、動物試験に対する有望な代替方法を表した。この暴露システムを使用して空気中の粒子に対する暴露実験には、以下のプロトコルが推奨されます。
Protocol
Representative Results
Discussion
近年、吸入可能粒子の急性吸入ハザードに関する情報を得て、3R原則25に従って動物実験を低減・置換するために、多くの非動物吸入毒性試験モデルが開発されている。
細胞培養モデルの面では、細胞の曝露は、水没条件下またはALIで行うことができる。水没した条件下で細胞を曝露すると、物理化学的性質に影響を及ぼす可能性があり、したがって、?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、ドイツ連邦教育研究省(ドイツ連邦大臣フュル・ビルドゥン・ウント・フォルチュン、BMBF、ドイツ(グラント031A581、サブプロジェクトA-D))、ドイツ研究財団(ドイツフォルシュンシュゲセルシャフト、DFG) によって支援されました。研究研修グループ GRK 2338)。
Materials
| Cells | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | |
| Cell culture medium and supplies | |||
| DMEM | Biochrom, Berlin, Germany | FG 0415 | used as growth medium |
| DMEM | Gibco-Invitrogen, Darmstadt, Germany | 22320 | used as exposure medium |
| FBS superior | Biochrom, Berlin, Germany | S 0615 | |
| Gentamycin (10mg/mL) | Biochrom, Berlin, Germany | A 2710 | |
| HEPES 1M | Th. Geyer, Renningen, Germany | L 0180 | |
| PBS | Biochrom, Berlin, Germany | L 1825 | |
| Trypsin/EDTA (0.05%/0.02%) | Biochrom, Berlin, Germany | L 2143 | |
| Cell culture material | |||
| CASY Cups | Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Germany | REF 05651794 | |
| Cell culture plates | Corning, Wiesbaden, Germany | 3516 | 6-well plates |
| Corning Transwell cell culture inserts | Corning, Wiesbaden, Germany | 3450 | 24mm inserts; 6-well plates; 0.4 µm |
| Chemicals | |||
| CASYton | Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Germany | REF 05651808001 | |
| Compressed Air (DIN EN 12021) | Linde Gas Therapeutics GmbH, Oberschleißheim, Germany | 2290152 | |
| WST-1 | Abcam, Cambridge, United Kingdom | ab155902 | |
| Instruments + equipment | |||
| CASY Cell Counter | Schärfe System GmbH, Reutlingen, Germany | ||
| Circulation thermostat | LAUDA, Lauda-Königshofen, Germany | Ecoline RE 100 | |
| CULTEX HyP – Hydraulic Press | Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany | ||
| CULTEX insert sleeve | Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany | ||
| CULTEX RFS – Radial Flow System Type 2 (module for particle exposure) | Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany | ||
| CULTEX RFS – Radial Flow System Type 2 (module for clean air exposure) | Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany | ||
| CULTEX supply | |||
| Flow controller 0-30 ml/min (IQ-Flow) | Bronkhorst Deutschland Nord GmbH | ||
| Flow controller 0-1,5 l/min (EL-Flow) | Bronkhorst Deutschland Nord GmbH | ||
| Filters (large) | Munktell & Filtrak GmbH, Sachsen, Germany | LP-050 | Munktell Sterile Filter; Particle retention efficiency > 99,999% |
| Filters (small) | Parker Hannifin Corporation, Mainz, Germany | 9933-05-DQ | Balston disposable filter |
| Medium pump | Cole-Parmer GmbH, Wertheim, Germany | Ismatec IPC High Precision Multichannel Dispenser | digital peristaltic pump |
| Microplate Reader Infinite M200 Pro | Tecan Deutschland GmbH, Crailsheim, Germany | ||
| Vakuum pump | KNF, Freiburg, Germany | N86 KT.18 | |
| Vögtlin mass flow controller 0,2-10 l/min | TrigasFI GmbH | Vögtlin red-y compact regulator, Typ-Nr.: GCR-C3SA-BA20 | |
| Water Bath | LAUDA, Lauda-Königshofen, Germany | Ecoline Staredition RE 104 |
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