Vi presenterer et robust, overførbart og prediktivt in vitro-eksponeringssystem for screening og overvåking av luftbårne partikler om deres akutte lungecytotoksisitet ved å utsette dyrkede menneskelige lungeceller ved luftvæskegrensesnittet (ALI).
Her presenterer vi et spesialdesignet modulær in vitro eksponeringssystem som muliggjør homogen eksponering av dyrkede menneskelige lungeceller ved ALI til gasser, partikler eller komplekse atmosfærer (f.eks. sigarettrøyk), og gir dermed realistisk fysiologisk eksponering av den apikale overflaten av den menneskelige alveolære regionen til luft. I motsetning til sekvensielle eksponeringsmodeller med lineær aerosolveiledning oppfyller den modulære utformingen av radialstrømningssystemet alle krav til kontinuerlig generasjon og transport av testatmosfæren til cellene, en homogen fordeling og avsetning av partiklene og kontinuerlig fjerning av atmosfæren. Denne eksponeringsmetoden er primært utformet for eksponering av celler for luftbårne partikler, men kan tilpasses eksponeringen av flytende aerosoler og svært giftige og aggressive gasser avhengig av aerosolgenereringsmetoden og materialet i eksponeringsmodulene .
Innenfor rammen av en nylig fullført valideringsstudie ble dette eksponeringssystemet bevist som en overførbar, reproduserbar og prediktiv screeningmetode for kvalitativ vurdering av akutt lungecytotoksisitet av luftbårne partikler, og dermed potensielt redusere eller erstatte dyreforsøk som normalt ville gi denne toksikologiske vurderingen.
Innånding av giftige luftbårne partikler er en folkehelsebekymring, noe som fører til en rekke helserisikoer over hele verden og mange millioner dødsfall årlig1,2. Klimaendringer, den pågående industriutviklingen og den økende etterspørselen etter energi-, landbruks- og forbrukerprodukter har bidratt til økningen av lungesykdommer de siste årene3,4,5,6. Kunnskap og evaluering av inhalerbare stoffer om akutt innåndingstoksisitet gir grunnlag for farevurdering og risikostyring, men denne informasjonen mangler fortsatt for et bredt spekter av disse stoffene7,8. Siden 2006 krever EUs kjemiske lovgivning REACH (Registrering, evaluering, autorisasjon og begrensning av kjemikalier) at allerede eksisterende og nylig introduserte produkter gjennomgår en toksikologisk karakterisering, inkludert innåndingsruten før de plasseres på markedet. Derfor fokuserer REACH på alternative og dyrefrie metoder, implementeringen av “3R”-prinsippet (Erstatning, raffinement og reduksjon av dyreforsøk) og bruk av passende in vitro-modeller9. I de senere årene har mange forskjellige og tilstrekkelige ikke-dyr innånding toksisitet testing modeller (f.eks in vitro celle kulturer, lunge-på-en-chip modeller, presisjon kuttet lungeskiver (PCLS)) er utviklet for å vurdere den akutte innånding toksisitet av luftbårne partikler5,7,10,11. Når det gjelder in vitro celle kultur modeller, dyrket celler kan bli utsatt under nedsenket forhold eller ved ALI (Figur 1). Imidlertid er gyldigheten av nedsenkede eksponeringsstudier begrenset med hensyn til evaluering av toksisiteten av luftbårne forbindelser, spesielt partikler. Nedsenket eksponeringsteknikker samsvarer ikke med den menneskelige in vivo-situasjonen; cellekulturmediet som dekker cellene kan påvirke fysico-kjemiske egenskaper og dermed de giftige egenskapene til et teststoff12,13. ALI in vitro innånding modeller tillate direkte eksponering av celler til teststoffer uten forstyrrelser av cellekulturmediet med testpartikler, dermed etterligne menneskelig eksponering med høyere fysiologisk og biologisk likhet enn nedsenket eksponering12,14.
For regulatoriske prosesser som REACH er imidlertid bare dyremodeller tilgjengelige innen akutt innånding toksikologi, da ingen alternative in vitro-metoder har blitt tilstrekkelig validert og offisielt akseptert så langt14. For dette formålet må testmodeller valideres i henhold til kravene til EUs referanselaboratorium for alternativer til dyretesting (EURL-ECVAM) prinsipper om testgyldighet15.
En tidligere pre-validering studie og en nylig fullført validering studie vellykket demonstrert e-området av CULTEX RFS eksponeringssystem og dens overførbarhet, stabilitet, og reproduserbarhet13. Dette eksponeringssystemet er et in vitro cellebasert eksponeringssystem som muliggjør homogen eksponering av celler for gasser, partikler eller komplekse atmosfærer (f.eks. sigarettrøyk) ved ALI på grunn av sitt radiale aerosoldistribusjonskonsept og ledning av testaerosolen i en kontinuerlig strøm over cellene16. Den grunnleggende modulen til dette radiale strømningssystemet består av innløpsadapteren, aerosolføringsmodulen med radial aerosoldistribusjon, prøvetaking og socket-modul og en låsemodul med et håndhjul (figur 2). De genererte partiklene når cellene via innløpsadapteren og aerosolføringsmodulen og deponeres på cellekulturinnsatsene, som ligger i de tre radialt arrangerte eksponeringskamrene i prøvetakingsmodulen. Aerosolføringsmodulen samt prøvetakingsmodulen kan varmes opp ved å koble til et eksternt vannbad17.
Innenfor rammen av begge studiene ble A549-celler brukt til alle eksponeringseksperimenter. Cellelinjen A549 er en human udødeliggjort epitelcellelinje som er svært godt karakterisert og har blitt brukt som in vitro-modell for type II alveolær epitelceller i mange toksikologiske studier. Cellene er preget av lamellære kropper, produksjon av overflateaktivt middel og en rekke betennelsesrelevante faktorer18. De viser også egenskaper av bronkial epitelceller på grunn av deres slimproduksjon19. Videre kan de dyrkes på ALI. Selv om denne cellelinjen er mangelfull i å bygge cellecellekontakter, er dyrkingen av disse cellene mye mer praktisk, billigere og resultater avledet av disse er donoruavhengige sammenlignet med primærceller20.
A549 celler ble seeded i 6-brønncellekulturinnsatser (PET membran, 4,67 cm2, porestørrelse 0,4 mm) med en tetthet på 3,0 x 105 celler per innsats og dyrket i 24 timer under nedsenket forhold. Cellene ble deretter eksponert i tre uavhengige laboratorier for ren luft og tre forskjellige eksponeringsdoser (25, 50 og 100 μg/cm2)av 20 teststoffer ved ALI. Eksponeringsdosen er korrelert med avsetningstiden, noe som resulterer i en konstant partikkelhastighet på henholdsvis 25 μg/cm2,50 μg/cm2 og 100 μg/cm2 på cellene etter henholdsvis 15, 30 eller 60 min. Deponerte partiklene ble imidlertid ikke vasket av etter avsetning, men forble på cellene i 24 timer. Partiklenes avsetningstider var derfor 15, 30 og 60 min, men eksponeringen av cellene varte totalt i 24 timer. Avsetningsfrekvensen for teststoffene ble bestemt i foreløpige eksperimenter i henhold til tidligere metoder17.
Cellelevedyktighet som en indikator på toksisitet ble vurdert 24 timer etter partikkelavsetning ved hjelp av en cellelevedyktighetsanalyse. Det ble satt spesielt fokus på kvaliteten på rene luftkontroller, optimalisering og raffinement av eksponeringsprotokollen, intra- og inter-laboratoriereproduserbarhet og etablering av en prediksjonsmodell (PM). Stoffer som førte til en reduksjon av cellelevedyktighet en under 50 % (PM 50 %) eller 75 % (PM 75 %) i noen av de tre eksponeringsdosene ble ansett for å utøve en akutt innåndingsfare. Resultatene ble deretter sammenlignet med eksisterende in vivo-data (basert på minst én pålitelig studie i henhold til OECDs testretningslinje (TG) 403 eller TG 43621,22), noe som førte til en samlet konkordans på 85 %, med en spesifisitet på 83 % og en følsomhet på 88 %23.
I tillegg til måling av cellelevedyktighet, kan andre endepunkter som cytokinfrigjøring, undersøkelse av cellelysat eller membranintegritet via LDH-analyse vurderes, men var ikke nødvendig for valideringsstudien. Dermed ble eksponeringssystemet (f.eks. CULTEX RFS) bevist som et prediktivt screeningsystem for kvalitativ vurdering av den akutte innåndingstoksisiteten til de testede luftbårne partiklene, som representerer en lovende alternativ metode for dyretesting. Følgende protokoll anbefales for eksponeringseksperimenter til luftbårne partikler ved hjelp av dette eksponeringssystemet.
Mange ikke-dyr innånding toksisitet testing modeller har blitt utviklet de siste årene for å få informasjon om akutt innånding fare for inhalerbare partikler og for å redusere og erstatte dyreforsøk i henhold til 3R prinsippet25.
Når det gjelder cellekulturmodeller, kan eksponering av celler gjøres under nedsenkede forhold eller ved ALI. Utsette celler under nedsenket forhold kan påvirke fysico-kjemiske egenskaper og dermed giftige egenskaper av en test stoff<…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av det tyske føderale utdannings- og forskningsdepartementet (Bundesministerium für Bildung und Forschung, BMBF, Tyskland (Grant 031A581, underprosjekt A-D)) og av Den tyske forskningsstiftelsen (Deutsche Forschungsgesellschaft, DFG, Forskningsopplæringsgruppe GRK 2338).
Cells | |||
A549 | ATCC | CCL-185 | |
Cell culture medium and supplies | |||
DMEM | Biochrom, Berlin, Germany | FG 0415 | used as growth medium |
DMEM | Gibco-Invitrogen, Darmstadt, Germany | 22320 | used as exposure medium |
FBS superior | Biochrom, Berlin, Germany | S 0615 | |
Gentamycin (10mg/mL) | Biochrom, Berlin, Germany | A 2710 | |
HEPES 1M | Th. Geyer, Renningen, Germany | L 0180 | |
PBS | Biochrom, Berlin, Germany | L 1825 | |
Trypsin/EDTA (0.05%/0.02%) | Biochrom, Berlin, Germany | L 2143 | |
Cell culture material | |||
CASY Cups | Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Germany | REF 05651794 | |
Cell culture plates | Corning, Wiesbaden, Germany | 3516 | 6-well plates |
Corning Transwell cell culture inserts | Corning, Wiesbaden, Germany | 3450 | 24mm inserts; 6-well plates; 0.4 µm |
Chemicals | |||
CASYton | Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Germany | REF 05651808001 | |
Compressed Air (DIN EN 12021) | Linde Gas Therapeutics GmbH, Oberschleißheim, Germany | 2290152 | |
WST-1 | Abcam, Cambridge, United Kingdom | ab155902 | |
Instruments + equipment | |||
CASY Cell Counter | Schärfe System GmbH, Reutlingen, Germany | ||
Circulation thermostat | LAUDA, Lauda-Königshofen, Germany | Ecoline RE 100 | |
CULTEX HyP – Hydraulic Press | Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany | ||
CULTEX insert sleeve | Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany | ||
CULTEX RFS – Radial Flow System Type 2 (module for particle exposure) | Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany | ||
CULTEX RFS – Radial Flow System Type 2 (module for clean air exposure) | Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany | ||
CULTEX supply | |||
Flow controller 0-30 ml/min (IQ-Flow) | Bronkhorst Deutschland Nord GmbH | ||
Flow controller 0-1,5 l/min (EL-Flow) | Bronkhorst Deutschland Nord GmbH | ||
Filters (large) | Munktell & Filtrak GmbH, Sachsen, Germany | LP-050 | Munktell Sterile Filter; Particle retention efficiency > 99,999% |
Filters (small) | Parker Hannifin Corporation, Mainz, Germany | 9933-05-DQ | Balston disposable filter |
Medium pump | Cole-Parmer GmbH, Wertheim, Germany | Ismatec IPC High Precision Multichannel Dispenser | digital peristaltic pump |
Microplate Reader Infinite M200 Pro | Tecan Deutschland GmbH, Crailsheim, Germany | ||
Vakuum pump | KNF, Freiburg, Germany | N86 KT.18 | |
Vögtlin mass flow controller 0,2-10 l/min | TrigasFI GmbH | Vögtlin red-y compact regulator, Typ-Nr.: GCR-C3SA-BA20 | |
Water Bath | LAUDA, Lauda-Königshofen, Germany | Ecoline Staredition RE 104 |