Bedömning av den akuta inandning toxicitet luftburna partiklar genom att exponera odlade mänskliga lungceller vid air-liquid interface
Summary
Vi presenterar ett robust, överförbart och prediktivt in vitro-exponeringssystem för screening och övervakning av luftburna partiklar om deras akuta pulmonell cytotoxicitet genom att exponera odlade mänskliga lungceller vid luftvätskegränssnittet (ALI).
Abstract
Här presenterar vi ett specialdesignat modulärt in vitro-exponeringssystem som möjliggör homogen exponering av odlade mänskliga lungceller vid ALI för gaser, partiklar eller komplexa atmosfärer (t.ex. cigarettrök), vilket ger realistisk fysiologisk exponering av den apikala ytan av den mänskliga alveolarregionen för luft. I motsats till sekventiella exponeringsmodeller med linjär aerosolvägledning uppfyller den modulära utformningen av det radiella flödessystemet alla krav för kontinuerlig generering och transport av testatmosfären till cellerna, en homogen fördelning och deposition av partiklarna och kontinuerligt avlägsnande av atmosfären. Denna exponeringsmetod är främst utformad för exponering av celler för luftburna partiklar, men kan anpassas till exponeringen av flytande aerosoler och mycket giftiga och aggressiva gaser beroende på aerosolgenereringsmetoden och materialet i exponeringsmodulerna .
Inom ramen för en nyligen avslutad valideringsstudie har detta exponeringssystem bevisats som en överförbar, reproducerbar och prediktiv screeningmetod för kvalitativ bedömning av luftburna partiklars akuta pulmonellcytotoxicitet, och därmed potentiellt minska eller ersätta djurförsök som normalt skulle ge denna toxikologiska bedömning.
Introduction
Inandning av giftiga luftburna partiklar är ett folkhälsoproblem, vilket leder till en mängd hälsorisker över hela världen och många miljoner dödsfall årligen1,2. Klimatförändringarna, den pågående industriella utvecklingen och den ökande efterfrågan på energi, jordbruks- och konsumentprodukter har bidragit till ökningen av lungsjukdomar under de senaste åren3,4,5,6. Kunskap och utvärdering av inandningsbara ämnen när det gäller deras akuta inandningstoxicitet utgör grunden för riskbedömning och riskhantering, men denna information saknas fortfarande för ett brett spektrum av dessa ämnen7,8. Sedan 2006 kräver EU:s kemikalielagstiftning Reach (registrering, utvärdering, tillstånd och begränsning av kemikalier) att redan befintliga och nyligen införda produkter genomgår en toxikologisk karakterisering, inklusive inhalationsvägen innan de släpps ut på marknaden. Reach fokuserar därför på alternativa och djurfria metoder, genomförandet av 3R-principen (ersättning, förfining och minskning av djurförsök) och användning av lämpliga in vitro-modeller9. Under de senaste åren har många olika och adekvata icke-djurinande toxicitetstestmodeller (t.ex. in vitro-cellkulturer, lung-on-a-chip-modeller, precisionssnitt lungskivor (PCLS)) utvecklats för att bedöma den akuta inhalationstoxiciteten hos luftburna partiklar5,7,10,11. När det gäller in vitro-cellsodlingsmodeller kan odlade celler exponeras under nedsänkta förhållanden eller vid ALI(figur 1). Giltigheten av studier med nedsänkt exponering är dock begränsad när det gäller utvärderingen av toxiciteten hos luftburna föreningar, särskilt partiklar. Metoder för nedsänkt exponering motsvarar inte den mänskliga in vivo-situationen. Cellodlingsmediet som täcker cellerna kan påverka de fysikalisk-kemiska egenskaperna och därmed de toxiska egenskaperna hos ett testämne12,13. ALI in vitro inhalationsmodeller möjliggör direkt exponering av celler på testämnena utan störningar i cellodlingsmediet med testpartiklar, vilket härmar exponeringen hos människor med högre fysiologiska och biologiska likheter än nedsänktexponering12,14.
För regleringsprocesser som Reach finns dock endast djurmodeller tillgängliga inom området akut inhalationstoxikologi, eftersom inga alternativa in vitro-metoder har validerats tillräckligt och officiellt accepterats hittills14. För detta ändamål måste testmodeller valideras i enlighet med kraven i Europeiska unionens referenslaboratorium för alternativ till djurförsök (EURL-ECVAM) principer om testgiltighet15.
En tidigare prevalideringsstudie och en nyligen avslutad valideringsstudie visade framgångsrikt tillämpningsområdet för CULTEX RFS-exponeringssystemet och dess överlåtbarhet, stabilitet och reproducerbarhet13. Detta exponeringssystem är ett in vitro-cellbaserat exponeringssystem som möjliggör homogen exponering av celler för gaser, partiklar eller komplexa atmosfärer (t.ex. cigarettrök) vid ALI på grund av dess radiella aerosoldistributionskoncept och testaerosolens genomförande i ett kontinuerligt flöde över cellerna16. Grundmodulen i detta radiella flödessystem består av inloppsadaptern, aerosolstyrmodulen med radiell aerosolfördelning, provtagnings- och socketmodulen och en låsmodul med handhjul (figur 2). De genererade partiklarna når cellerna via inloppsadaptern och aerosolledstången och deponeras på cellodlingsskären, som finns i provtagningsmodulens tre radiellt arrangerade exponeringskammare. Aerosolens styrmodul samt provtagningsmodulen kan värmas upp genom att ansluta till ett externt vattenbad17.
Inom ramen för båda studierna användes A549-celler för alla exponeringsexperiment. Cellinjen A549 är en humanförevigad epitelcellinje som är mycket välkarakteriserad och har använts som en in vitro-modell för typ II alveolar epitelceller i många toxikologiska studier. Cellerna kännetecknas av lamellar kroppar, produktion av ytaktiva och ett antal inflammation-relevanta faktorer18. De visar också egenskaper bronkial epitelceller på grund av deras slem produktion19. Dessutom kan de odlas på ALI. Även om denna cellinje är brist på att bygga cell-cell kontakter, är odling av dessa celler mycket bekvämare, billigare dyra och resultat som härrör därav är givaroberoende jämfört med primära celler20.
A549 celler var seedade i 6-brunn cell odling skär (PET membran, 4,67 cm2,por storlek 0,4 mm) med en densitet på 3,0 x 105 celler per skär och odlas för 24 h under nedsänkta förhållanden. Celler exponerades sedan i tre oberoende laboratorier för ren luft och tre olika exponeringsdoser (25, 50 och 100 μg/cm2)av 20 testämnen vid ALI. Exponeringsdosen är korrelerad till deponeringstiden, vilket resulterar i en konstant partikelhastighet på 25 μg/cm2,50 μg/cm2 och 100 μg/cm2 på cellerna efter 15, 30 respektive 60 min. De deponerade partiklarna tvättades dock inte av efter nedfall, utan förblev på cellerna i 24 timmar. Partiklarnas nedfall var därför 15, 30 och 60 min, men cellernas exponering varade i totalt 24 timmar. Testämnenas nedfall spåddes i preliminära experiment enligt tidigare metoder17.
Celllönsamhet som en indikator på toxicitet bedömdes 24 timmar efter partikelnedfall med hjälp av en celllönsamhetsanalys. Särskild vikt lades på kvaliteten på ren luft kontroller, optimering och förfining av exponeringsprotokollet, intra- och inter-laboratory reproducerbarhet och inrättandet av en förutsägelse modell (PM). Ämnen som ledde till en minskning av celllönsamheten under 50 % (PM 50%) eller 75% (PM 75%) vid någon av de tre exponeringsdoserna ansågs utöva en akut inandningsrisk. Resultaten jämfördes sedan med befintliga in vivo-data (baserat på minst en tillförlitlig studie enligt OECD:s testriktlinje (TG) 403 eller TG 43621,22), vilket ledde till en övergripande överensstämmelse på 85 %, med en specificitet på 83 % och en känslighet på 88 %23.
Förutom mätning av celllivskraft kan andra effektmått som cytokinfrisättning, undersökning av celllysat eller membranintegritet via LDH-analys bedömas men inte krävdes för valideringsstudien. Exponeringssystemet (t.ex. CULTEX RFS) har således bevisats som ett prediktivt screeningsystem för kvalitativ bedömning av den akuta inhalationstoxiciteten hos de testade luftburna partiklarna, vilket motsvarar en lovande alternativ metod för djurförsök. Följande protokoll rekommenderas för exponeringsexperiment för luftburna partiklar som använder detta exponeringssystem.
Protocol
Representative Results
Discussion
Många icke-djurinande toxicitettestmodeller har utvecklats under de senaste åren för att få information om den akuta inhalationsrisken för inandningsbara partiklar och för att minska och ersätta djurförsök enligt 3R-principen25.
När det gäller cellodlingsmodeller kan exponering av celler göras under nedsänkta förhållanden eller vid ALI. Att exponera celler under nedsänkta förhållanden kan påverka de fysikalisk-kemiska egenskaperna och därmed de toxis…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av det tyska federala ministeriet för utbildning och forskning (Bundesministerium für Bildung und Forschung, BMBF, Tyskland (Grant 031A581, delprojekt A-D)) och av Den tyska forskningsstiftelsen (Deutsche Forschungsgesellschaft, DFG, Forskargrupp EN GRK 2338).
Materials
| Cells | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | |
| Cell culture medium and supplies | |||
| DMEM | Biochrom, Berlin, Germany | FG 0415 | used as growth medium |
| DMEM | Gibco-Invitrogen, Darmstadt, Germany | 22320 | used as exposure medium |
| FBS superior | Biochrom, Berlin, Germany | S 0615 | |
| Gentamycin (10mg/mL) | Biochrom, Berlin, Germany | A 2710 | |
| HEPES 1M | Th. Geyer, Renningen, Germany | L 0180 | |
| PBS | Biochrom, Berlin, Germany | L 1825 | |
| Trypsin/EDTA (0.05%/0.02%) | Biochrom, Berlin, Germany | L 2143 | |
| Cell culture material | |||
| CASY Cups | Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Germany | REF 05651794 | |
| Cell culture plates | Corning, Wiesbaden, Germany | 3516 | 6-well plates |
| Corning Transwell cell culture inserts | Corning, Wiesbaden, Germany | 3450 | 24mm inserts; 6-well plates; 0.4 µm |
| Chemicals | |||
| CASYton | Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Germany | REF 05651808001 | |
| Compressed Air (DIN EN 12021) | Linde Gas Therapeutics GmbH, Oberschleißheim, Germany | 2290152 | |
| WST-1 | Abcam, Cambridge, United Kingdom | ab155902 | |
| Instruments + equipment | |||
| CASY Cell Counter | Schärfe System GmbH, Reutlingen, Germany | ||
| Circulation thermostat | LAUDA, Lauda-Königshofen, Germany | Ecoline RE 100 | |
| CULTEX HyP – Hydraulic Press | Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany | ||
| CULTEX insert sleeve | Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany | ||
| CULTEX RFS – Radial Flow System Type 2 (module for particle exposure) | Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany | ||
| CULTEX RFS – Radial Flow System Type 2 (module for clean air exposure) | Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany | ||
| CULTEX supply | |||
| Flow controller 0-30 ml/min (IQ-Flow) | Bronkhorst Deutschland Nord GmbH | ||
| Flow controller 0-1,5 l/min (EL-Flow) | Bronkhorst Deutschland Nord GmbH | ||
| Filters (large) | Munktell & Filtrak GmbH, Sachsen, Germany | LP-050 | Munktell Sterile Filter; Particle retention efficiency > 99,999% |
| Filters (small) | Parker Hannifin Corporation, Mainz, Germany | 9933-05-DQ | Balston disposable filter |
| Medium pump | Cole-Parmer GmbH, Wertheim, Germany | Ismatec IPC High Precision Multichannel Dispenser | digital peristaltic pump |
| Microplate Reader Infinite M200 Pro | Tecan Deutschland GmbH, Crailsheim, Germany | ||
| Vakuum pump | KNF, Freiburg, Germany | N86 KT.18 | |
| Vögtlin mass flow controller 0,2-10 l/min | TrigasFI GmbH | Vögtlin red-y compact regulator, Typ-Nr.: GCR-C3SA-BA20 | |
| Water Bath | LAUDA, Lauda-Königshofen, Germany | Ecoline Staredition RE 104 |
References
- Faber, S. C., McCullough, S. D. Through the Looking Glass: In vitro Models for Inhalation Toxicology and Interindividual Variability in the Airway. Applied In vitro Toxicology. 4 (2), 115-128 (2018).
- De Matteis, S., et al. Current and new challenges in occupational lung diseases. European Respiratory Review. 26 (146), 1-15 (2017).
- LANUV Nordrhein-Westfalen. . Gesundheitliche Risiken von Nanomaterialien nach inhalativer Aufnahme. , (2009).
- Bérubé, K., et al. In vitro Models of Inhalation Toxicity and Disease. The report of a FRAME workshop. Alternatives To Laboratory Animals. 37 (1), 89-141 (2009).
- Lopez, A. D., Murray, C. C. The global burden of disease, 1990-2020. Nature Medicine. 4 (11), 1241-1243 (1998).
- Clippinger, A. J., et al. Alternative approaches for acute inhalation toxicity testing to address global regulatory and non-regulatory data requirements: An international workshop report. Toxicology In vitro. 48, 53-70 (2018).
- Agrawal, M. R., Winder, C. Frequency and Occurrence of LD50 Values for Materials in the Workplace. Journal Of Applied Toxicology. 16 (5), 407-422 (1996).
- Amtsblatt der Europäischen Union. Verordnung (EG) Nr. 1907/2006 des Europäischen Parlaments und des Rates. Europäische Union. 860, (2006).
- Huh, D., et al. Reconstituting Organ-Level Lung Functions on a Chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
- Fisher, R. L., et al. The Use of Human Lung Slices in Toxicology. Human and Experimental Toxicology. 13 (7), 466-471 (1994).
- Lenz, A. G., et al. Inflammatory and Oxidative Stress Responses of an Alveolar Epithelial Cell Line to Airborne Zinc Oxide Nanoparticles at the Air-Liquid Interface. Biomed Research International. 12, (2013).
- Steinritz, D., et al. Use of the CULTEX Radial Flow System as an in vitro exposure method to assess acute pulmonary toxicity of fine dusts and nanoparticles with special focus on the intra- and inter-laboratory reproducibility. Chemico-Biological Interactions. 206 (3), 479-490 (2013).
- Lacroix, G., et al. Air-Liquid Interface In vitro Models for Respiratory Toxicology Research. Applied In vitro Toxicology. 4 (2), 91-106 (2018).
- Eskes, C., Whelan, M. . Validation of Alternative Methods for Toxicity Testing. 418, (2016).
- Rach, J., Budde, J., Möhle, N., Aufderheide, M. Direct exposure at the air-liquid interface: Evaluation of an in vitro approach for simulating inhalation of airborne substances. Journal Of Applied Toxicology. 34 (5), 506-515 (2014).
- Aufderheide, M., Halter, B., Möhle, N., Hochrainer, D. The CULTEX RFS: A comprehensive Technical Approach for the In vitro Exposure of Airway Epithelial Cells to the Particulate Matter at the Air-Liquid Interface. Biomed Research International. 15, (2013).
- Lieber, M., Todaro, G., Smith, B., Szakal, A., Nelson-Rees, W. A continuous tumor-cell line from a human lung carcinoma with properties of type II alveolar epithelial cells. International Journal Of Cancer. 17 (1), 62-70 (1976).
- Carterson, A. J., et al. A549 lung epithelial cells grown as three-dimensional aggregates: Alternative tissue culture model for Pseudomonas aeruginosa pathogenesis. Infection And Immunity. 73 (2), 1129-1140 (2005).
- Kim, K. J., Borok, Z., Crandall, E. D. A useful in vitro model for transport studies of alveolar epithelial barrier. Pharmaceutical Research. 18 (3), 253-255 (2001).
- OECD. Test No. 403: Acute Inhalation Toxicity. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4. , (2009).
- OECD. Test No. 436: Acute Inhalation Toxicity – Acute Toxic Class Method. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4. , (2009).
- Tsoutsoulopoulos, A., et al. Validation of the CULTEX Radial Flow System for the assessment of the acute inhalation toxicity of airborne particles. Toxicology In vitro. 58, 245-255 (2019).
- Tsoutsoulopoulos, A., et al. A novel exposure system generating nebulized aerosol of sulfur mustard in comparison to the standard submerse exposure. Chemico-Biological Interactions. 298, 121-128 (2019).
- Tsoutsoulopoulos, A., et al. Optimization of the CULTEX radial flow system for in vitro investigation of lung damaging agents. Toxicology Letters. 244, 28-34 (2016).
- Osman, J. J., Birch, J., Varley, J. The response of GS-NS0 myeloma cells to pH shifts and pH perturbations. Biotechnology and Bioengineering. 75 (1), 63-73 (2001).
- OECD. Test Guideline 433: Acute Inhalation Toxicity – Acute Toxic Class Method. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4. , (2018).
- OECD. . Guidance Document on Inhalation Toxicity Studies. , (2018).
