中国仓鼠卵巢细胞培养中高通量自动化微生物反应器工艺优化
Summary
在这里，我们提出了一个详细的过程，在自动化的微生物反应器中运行实验设计，然后使用蛋白质A柱进行细胞收获和蛋白质定量。
Abstract
优化生物工艺，提高所需产品的产量，在生物制药行业具有重要意义。这可以通过菌株选择和开发生物工艺参数来实现。摇瓶已用于此目的。然而，它们缺乏控制过程参数的能力，如pH值和溶解氧 （DO）。在自动化微生物反应器的帮助下，可以克服这一限制。这些生物反应器模仿大规模种植。该系统的主要优点之一是实验设计（DOE）在软件中集成。这种集成可以建立一个可以同时改变多个过程参数的设计。可在软件内分析关键工艺参数和最佳生物工艺条件。此处介绍的工作重点是向用户介绍软件中过程设计所涉及的步骤，并将 DOE 纳入培养运行中。
Introduction
2018年全球生物制药市场价值超过2500亿美元，并不断扩大1.制药公司正在从生产小分子药物转向生物技术产生的治疗药物，如重组蛋白。仅此一项，收入就超过1500亿美元。哺乳动物细胞现在广泛用于这些药物重组蛋白的产生。在目前68种经批准的哺乳动物细胞产品中，有57种是由中国仓鼠卵巢细胞（CHO）2产生的。CHO细胞专门用于生产需要翻译后修饰的重组蛋白。这些细胞是首选，因为它们生长在悬浮液中，从而在无血清化学定义的介质33，44中产生可重复的结果。使用CHO细胞的另一个优点是，该产品的甘油结构类似于人类单克隆抗体（mAb），由于基因扩增5，导致重组蛋白产量和特定生产力提高。
重组性CHO（rCHO）细胞培养的产量在过去二十年中增加了一百倍。这一改进归功于工艺参数的优化、喂养策略以及血清无化学定义的介质6的开发。随着药品需求的增加，生产过程发展的成本和时间效率的压力增加7.为了减轻压力，同时保证产品质量，制药行业的重点已转向设计质量 （QbD）。QbD 用于了解产品生产和流程。ObD 中使用的一个重要工具是实验设计 （DOE）。它通过揭示各种输入变量和结果输出数据之间的关系，帮助增加对流程的理解。在项目早期阶段，应用 DOE 方法优化生物工艺，有利于实现工艺条件，提高数量和质量。与老式策略相比，这种方法是有益的：一次一个因子 （OFAT）。使用经典、沙宁或塔古奇的DOE的统计方法远远优于OFAT8。
过程和介质优化可以在摇瓶中执行。烧瓶相对便宜。但是，无法控制温度、pH 值和溶解氧 （DO） 等参数。为了克服这些缺点，可以使用从工作体积为 0.5 L 到 5 L 的多用途台式生物反应器。这些反应堆提供广泛的在线监测和过程控制。然而，多用途生物反应器的使用是时间和劳动密集型的。为了克服这些缺点，采用了一种新型的一次性生物反应器，它结合了监测台式生物反应器的综合过程和易于处理摇瓶。高吞吐量筛选系统和一次性技术为提高工艺性能和开发效率做出了贡献。
在本文中，列出了在自动微生物反应器 （AMBR） 软件中加载配方的指南。本实验过程中研究了不同搅拌速度和pH值对活细胞浓度（VCC）和滴度的影响。实验软件MODDE12的设计进行了实验结果和分析。产品分析在带有蛋白质 A 柱的高压液相色谱 （HPLC） 系统中进行。它基于mAb的Fc区域与高亲和力10，11,11的蛋白质A结合的原则。使用此方法，可以识别和量化 mAb。定量在280nm的测量洗脱峰区进行。
Protocol
Representative Results
Discussion
优化工艺，提高产量，对生物制药行业至关重要。摇瓶可能用于菌株的筛选;但是，在烧瓶中不监视过程参数（如 pH 和 DO）。微生物反应器具有优势，因为它们允许对过程进行持续监测和控制。微生物反应器中的这些控制回路也提供了与更大规模类似的条件，因此，其结果可与较大规模的生物反应器相媲美。微生物反应器的另一个优点是，与台式生物反应器相比，在时间和人工方面</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者感谢德国联邦教育和研究部联邦联邦联邦部长比尔东·福森（BMBF）和德国萨托里乌斯·斯蒂迪姆生物技术有限公司的生物加工团队的支持。
Materials
| 1 mL disposable pipette tips, sterilized | Sartorius Stedim Biotech GmbH | A-0040 | |
| 200 mM L-glutamine | Corning, Merck | 25-005-CV | |
| 24 Well deep well plates | Sartorius Stedim Biotech GmbH | A-0038 | |
| 5 mL disposable pipette tips, sterilized | Sartorius Stedim Biotech GmbH | A-0039 | |
| ambr 15 automated microbioreactor system | Sartorius Stedim Biotech GmbH | 001-2804 | |
| ambr 15 Cell Culture 24 Disposable Bioreactors – Sparged | Sartorius Stedim Biotech GmbH | 001-1B86 | |
| Antifoam C Emulsion | Sigma-Aldrich, Merck | A8011 | |
| Bottle Top Sterile filter | Corning, Merck | CLS431474 | 0.1 μm pore size |
| CEDEX Detergent (3% Mucosol) | Roche Innovatis AG | 05-650-658-001 | |
| Cell counter | Roche Innovatis AG | 05-650-216-001 | CEDEX HiRes |
| CHO DG44 cell line | Cellca, Sartorius Stedim Biotech GmbH | ||
| CHOKO Feed Media A (FMA) | Sigma-Aldrich, Merck | CR80025 | |
| CHOKO Feed Media B (FMB) | Sigma-Aldrich, Merck | CR80026 | |
| CHOKO Production Medium | Sigma-Aldrich, Merck | CR80027 | |
| CHOKO Stock Culture Meium | Sigma-Aldrich, Merck | CR80028 | |
| Chromaster high pressure liquid chromatography system | VWR International | ||
| Conical Centrifuge tube | Corning, Merck | SIAL0790 | |
| Ethanol | Merck | 1070179026 | |
| Glycine | Carl Roth | 56-40-6 | |
| HPLC Vials | VWR International | SUPLSU860181 | |
| PBS | Sigma-Aldrich,Merck | P4417 | |
| Protein A Column | Thermo Fisher Scientific | 1502226 | POROS™ A 1.7 mL |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich,Merck | 7647-14-5 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous | Sigma-Aldrich,Merck | 7558-79-4 | |
| Trypan Blue | VWR International | VWRVK940 | |
| YSI | YSI Inc | 2900D | YSI 2900 Select |
References
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