Prozessoptimierung mit automatisierten Mikro-Bioreaktoren mit hohem Durchsatz in der chinesischen Hamster-Ovarialzell-Kultivierung
Summary
Hier stellen wir ein detailliertes Verfahren zur Ausführung eines Experimentsentwurfs in einem automatisierten Mikrobioreaktor vor, gefolgt von der Zellernte und der Proteinquantifizierung mit einer Protein-A-Säule.
Abstract
Die Optimierung von Bioprozessen zur Ertragssteigerung der gewünschten Produkte ist in der biopharmazeutischen Industrie von Bedeutung. Dies kann durch die Dehnungsauswahl und durch die Entwicklung von Bioprozessparametern erreicht werden. Zu diesem Zweck wurden Schüttelkolben verwendet. Sie sind jedoch nicht in der Lage, die Prozessparameter wie pH und gelösten Sauerstoff (DO) zu steuern. Diese Einschränkung kann mit Hilfe eines automatisierten Mikrobioreaktors überwunden werden. Diese Bioreaktoren imitieren den Anbau in größerem Maßstab. Einer der Hauptvorteile dieses Systems ist die Integration des Design of Experiment (DOE) in die Software. Diese Integration ermöglicht die Erstellung eines Entwurfs, bei dem mehrere Prozessparameter gleichzeitig variiert werden können. Die kritischen Prozessparameter und optimalen Bioprozessbedingungen können innerhalb der Software analysiert werden. Im Mittelpunkt der hier vorgestellten Arbeit steht die Einführung der Schritte der Prozessgestaltung in der Software und der Einbindung des DOE in den Kultivierungslauf.
Introduction
Der globale biopharmazeutische Markt war 2018 mehr als 250 Milliarden US-Dollar wert und hat sich kontinuierlich erweitert1. Pharmaunternehmen bewegen sich von der Herstellung kleiner molekularer Medikamente hin zu biotechnologisch hergestellten Therapeutika wie rekombinanten Proteinen. Diese allein sind für einen Umsatz von mehr als 150MilliardenUS-Dollar verantwortlich. Säugetierzellen werden heute ausgiebig für die Herstellung dieser pharmazeutischen rekombinanten Proteine verwendet. In der aktuellen Periode werden 57 der 68 von Säugetierzellen hergestellten Produkte von chinesischen Hamster-Ovarialzellen (CHO)2produziert. CHO-Zellen werden speziell für die Herstellung von rekombinanten Proteinen verwendet, die posttranslationale Modifikationen erfordern. Diese Zellen werden bevorzugt, da sie in einer Suspension wachsen und ermöglichen dadurch reproduzierbare Ergebnisse in einem serumfreien chemisch definierten Medium3,4. Der andere Vorteil der Verwendung von CHO-Zellen ist, dass die Glyschstruktur des Produkts der des menschlichen monoklonalen Antikörpers (mAb) ähnelt und zu einer höheren rekombinanten Proteinausbeute und spezifischen Produktivität aufgrund der Genverstärkungführt 5.
Die Ausbeute der rekombinanten CHO(rCHO) Zellkultur hat sich in den letzten zwei Jahrzehnten um das Hundertfache erhöht. Diese Verbesserung ist auf die Optimierung der Prozessparameter, die Fütterungsstrategie und die Entwicklung des serumfreien chemisch definierten Mediums6zurückzuführen. Mit dem steigenden Bedarf an pharmazeutischen Produkten erhöht sich der Druck auf Kosten und Zeiteffizienz bei der Entwicklung des Produktionsprozesses7. Um den Druck zu reduzieren und gleichzeitig die Produktqualität zu sichern, wurde der Fokus der pharmazeutischen Industrie auf Quality by Design (QbD) umgelenkt. QbD wird verwendet, um die Produktproduktion sowie den Prozess zu verstehen. Ein wichtiges Werkzeug, das im ObD verwendet wird, ist das Design of Experiment (DOE). Es trägt dazu bei, das Verständnis des Prozesses zu erhöhen, indem die Beziehung zwischen verschiedenen Eingabevariablen und resultierenden Ausgabedaten aufgedeckt wird. Die Anwendung des DOE-Ansatzes zur Optimierung des Bioprozesses ist in den frühen Phasen des Projekts von Vorteil, um die Prozessbedingungen zu assimilieren und die Titermenge und -qualität zu erhöhen. Dieser Ansatz ist vorteilhaft im Vergleich zur altmodischen Strategie: One-Factor-at-a-time (OFAT). Die statistischen Ansätze für DOE mit Klassik, Shainin oder Taguchi sind dem OFAT8weit überlegen.
Die Prozess- und Medienoptimierung kann in Schüttelkolben durchgeführt werden. Die Kolben sind relativ preiswert. Es ist jedoch nicht möglich, Parameter wie Temperatur, pH-Wert und gelösten Sauerstoff (DO) zu steuern. Um diese Nachteile zu überwinden, können Multiuse-Bench-Top-Bioreaktoren von einem Arbeitsvolumen von 0,5 l bis 5 L verwendet werden. Die Reaktoren bieten eine umfassende Online-Überwachung und Prozesskontrolle. Der Einsatz des Mehrzweck-Bioreaktors ist jedoch zeit- und arbeitsintensiv. Um diese Nachteile zu überwinden, wird ein neuartiger Einweg-Bioreaktor eingesetzt, der den umfassenden Prozess der Überwachung des Tischbioreaktors und die einfache Handhabung des Schüttelkolbens kombiniert. Das Hochdurchsatz-Screening-System und die Einwegtechnologie haben dazu beigetragen, die Effizienz der Prozessleistung und -entwicklung zu steigern9.
In diesem Artikel sind die Richtlinien zum Laden des Rezepts in die automatisierte Mikrobioreaktor-Software (AMBR) aufgeführt. Der Einfluss unterschiedlicher Rührgeschwindigkeiten und pH-Werte auf die lebensfähige Zellkonzentration (VCC) und den Titer wird im Laufe dieses Experiments untersucht. Das experimentelle Ergebnis und die Analyse werden mit dem Entwurf der Experimentiersoftware MODDE 12 durchgeführt. Die Produktanalyse erfolgt in einem Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie-System (HPLC) mit einer Protein-A-Säule. Es basiert auf dem Prinzip, dass die Fc-Region des mAb an Protein A mit hoher Affinität10,11bindet. Mit dieser Methode ist es möglich, das mAb zu identifizieren und zu quantifizieren. Die Quantifizierung erfolgt über die gemessenen Elutionsspitzenflächen bei 280 nm.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Optimierung des Prozesses zur Ertragssteigerung ist in der biopharmazeutischen Industrie von entscheidender Bedeutung. Schüttelkolben könnten möglicherweise für das Screening der Sorte verwendet werden; Die Überwachung der Prozessparameter wie pH und DO ist jedoch in den Kolben nicht verfügbar. Die Mikrobioreaktoren haben einen Vorteil, da sie eine kontinuierliche Überwachung und Kontrolle des Prozesses ermöglichen. Diese Regelkreise im Mikrobioreaktor bieten auch einen ähnlichen Zustand wie in größerem Ma…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken dem Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF), dem Bundesministerium für Bildung und Forschung, Deutschland, und dem BioProcessing-Team der Sartorius Stedim Biotech GmbH, Deutschland, für ihre Unterstützung.
Materials
| 1 mL disposable pipette tips, sterilized | Sartorius Stedim Biotech GmbH | A-0040 | |
| 200 mM L-glutamine | Corning, Merck | 25-005-CV | |
| 24 Well deep well plates | Sartorius Stedim Biotech GmbH | A-0038 | |
| 5 mL disposable pipette tips, sterilized | Sartorius Stedim Biotech GmbH | A-0039 | |
| ambr 15 automated microbioreactor system | Sartorius Stedim Biotech GmbH | 001-2804 | |
| ambr 15 Cell Culture 24 Disposable Bioreactors – Sparged | Sartorius Stedim Biotech GmbH | 001-1B86 | |
| Antifoam C Emulsion | Sigma-Aldrich, Merck | A8011 | |
| Bottle Top Sterile filter | Corning, Merck | CLS431474 | 0.1 μm pore size |
| CEDEX Detergent (3% Mucosol) | Roche Innovatis AG | 05-650-658-001 | |
| Cell counter | Roche Innovatis AG | 05-650-216-001 | CEDEX HiRes |
| CHO DG44 cell line | Cellca, Sartorius Stedim Biotech GmbH | ||
| CHOKO Feed Media A (FMA) | Sigma-Aldrich, Merck | CR80025 | |
| CHOKO Feed Media B (FMB) | Sigma-Aldrich, Merck | CR80026 | |
| CHOKO Production Medium | Sigma-Aldrich, Merck | CR80027 | |
| CHOKO Stock Culture Meium | Sigma-Aldrich, Merck | CR80028 | |
| Chromaster high pressure liquid chromatography system | VWR International | ||
| Conical Centrifuge tube | Corning, Merck | SIAL0790 | |
| Ethanol | Merck | 1070179026 | |
| Glycine | Carl Roth | 56-40-6 | |
| HPLC Vials | VWR International | SUPLSU860181 | |
| PBS | Sigma-Aldrich,Merck | P4417 | |
| Protein A Column | Thermo Fisher Scientific | 1502226 | POROS™ A 1.7 mL |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich,Merck | 7647-14-5 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous | Sigma-Aldrich,Merck | 7558-79-4 | |
| Trypan Blue | VWR International | VWRVK940 | |
| YSI | YSI Inc | 2900D | YSI 2900 Select |
References
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