Un método revisado para inducir el linfedema secundario en la extremidad posterior de los ratones

Summary

Este modelo animal permite a los investigadores inducir linfedema secundario estadísticamente significativo en la extremidad posterior de los ratones, que dura al menos 8 semanas. El modelo se puede utilizar para estudiar la fisiopatología del linfedema e investigar nuevas opciones de tratamiento.

Abstract

Los modelos animales son de suma importancia en la investigación del linfedema con el fin de entender la fisiopatología de la enfermedad, pero también para explorar posibles opciones de tratamiento. Este modelo de ratón permite a los investigadores inducir linfedema significativo que dura al menos 8 semanas. El linfedema se induce mediante una combinación de radioterapia fraccionada y ablación quirúrgica de linfáticos. Este modelo requiere que los ratones reciban una dosis de 10 radiación gris (gy) antes y después de la cirugía. La parte quirúrgica del modelo implica la ligadura de tres vasos linfáticos y la extracción de dos ganglios linfáticos de la extremidad posterior del ratón. Tener acceso a herramientas microquirúrgicas y un microscopio es esencial, debido a las pequeñas estructuras anatómicas de los ratones. La ventaja de este modelo es que resulta en un linfedema estadísticamente significativo, que proporciona una buena base para evaluar diferentes opciones de tratamiento. También es una gran opción y fácilmente disponible para el entrenamiento microquirúrgico. La limitación de este modelo es que el procedimiento puede llevar mucho tiempo, especialmente si no se practica de antemano. El modelo da como resultado un linfedema objetivamente cuantificable en ratones, sin causar morbilidad grave y ha sido probado en tres proyectos separados.

Introduction

El linfedema se caracteriza por una acumulación de líquido linfático que conduce a la hinchazón localizada del tejido, que se produce principalmente debido a la alteración o alteración del flujo de líquido linfático en los vasos linfáticos¹. El flujo linfático puede verse afectado o interrumpido por infección, obstrucción, lesiones o defectos congénitos en el sistema linfático². Estas etiologías dan lugar a la acumulación de líquido linfático, lo que conduce a un estado crónico de inflamación, lo que resulta en fibrosis posterior, así como la deposición de tejido adiposo³. El linfedema se puede clasificar como linfedema primario o secundario. El linfedema primario es causado por anomalías del desarrollo o mutación genética^2,4. El linfedema secundario ocurre debido a una enfermedad sistémica subyacente, cirugía o^{traumatismo2,4}. El linfedema secundario es la forma más común de linfedema en el mundo². En los países desarrollados, la causa más común del linfedema secundario es la terapia oncológica como la radioterapia adyuvante y la disección⁵de los ganglios linfáticos. El linfedema es más frecuente entre los pacientes con cáncer de mama, pero también puede desarrollarse en pacientes con cáncer ginecológico, melanoma, genitourinario o de cuello^6. Se ha sugerido que de todas las mujeres diagnosticadas con cáncer de mama, el 21% desarrollará linfedema^7.

El linfedema puede ser estresante para el paciente tanto física como psicológicamente. Los pacientes con linfedema tienen un mayor riesgo de infección^5,8,9, mala calidad de vida y pueden desarrollar ansiedad social y síntomas de depresión¹⁰. Las complicaciones del linfedema crónico conducen a un alto costo de atención y un aumento de la carga de morbilidad^9,11. Los hallazgos también han sugerido que el linfedema podría estar asociado con un mayor riesgo de muerte después del tratamiento con cáncer de mama¹². El manejo conservador, como la compresión de la zona afectada, el drenaje linfático manual y el cuidado general de la piel, siguen siendo el primer enfoque. Actualmente no existe un tratamiento curativo⁶. Aunque se han hecho progresos en el campo de la terapia quirúrgica y médica, todavía hay margen de mejora. Se necesita más investigación, que proporciona información sobre la fisiopatología y la progresión de la enfermedad, para permitir a los médicos proporcionar mejores opciones de tratamiento para los pacientes^5.

Los modelos animales se utilizan en la investigación preclínica para comprender la fisiopatología de las enfermedades y desarrollar posibles opciones de tratamiento. Se han establecido varios modelos animales de linfedema diferentes en caninos^13,14,conejos^15,ovejas^16,cerdos^17,18 y roedores^{19,20, 21,22,23,24}. El modelo de roedores parece ser el modelo más rentable, al investigar la reconstrucción de la función linfática, debido a que los roedores son fácilmente accesibles y relativamente de bajo precio²⁵. La mayoría de los modelos de ratones se han centrado en inducir linfedema en la cola de los ratones^21,22,23. El modelo de cola es muy fiable, pero la técnica quirúrgica exacta para inducir el linfedema varía significativamente en el material publicado anteriormente. Esto se traduce en fluctuaciones en la duración y robustez del linfedema desarrollado presentado en la litteratura conocida²⁵. También se están utilizando diferentes técnicas para inducir linfedema en el modelo de la extremidad posterior y también producen resultados variables, pero el modelo de la extremidad posterior podría ser más fácil de entender desde una perspectiva traslacional. Los modelos de linfedema anteriores se han visto obstaculizados por la resolución espontánea del linfedema y, por lo tanto, se necesita un modelo de linfedema reproducible y permanente^25. Los investigadores han tratado previamente de aumentar la dosis de radiación, para prevenir la resolución espontánea del linfedema, pero esto a menudo ha llevado a la posterior morbilidad grave²⁵.

Este modelo resulta en un linfedema estadísticamente significativo, sin causar morbilidad grave, combinando microcirugía con radiación. El modelo ha sido revisado a partir de un modelo quirúrgico anterior añadiendo una dosis de irradiación que induce linfedema, sin causar morbilidad grave^26. También ofrece una gran oportunidad para la formación microquirúrgica. Es necesario tener acceso a equipos microquirúrgicos y un microscopio, debido a las pequeñas estructuras anatómicas de los ratones. El procedimiento quirúrgico se puede realizar cuando al usuario se le han enseñado técnicas microquirúrgicas básicas, como la sutura con instrumentos microquirúrgicos. Los operadores que realizaron este procedimiento vieron videos tutoriales de Acland sobre las condiciones previas de las habilidades microquirúrgicas (1981) y la técnica básica de microsutura (1985). Recomendamos practicar el procedimiento quirúrgico 8 a 10 veces antes de usarlo en la investigación. La práctica del procedimiento garantiza que se cometan menos errores y que el procedimiento se pueda realizar de forma más eficiente. Cuando se domina, el procedimiento quirúrgico se puede realizar en 45 minutos.

Protocol

Los animales fueron alojados en la Instalación de Cuidado de Animales de la Universidad del Sur de Dinamarca según las directrices institucionales. Todos los procedimientos relacionados con sujetos animales han sido aprobados por la Inspección de Experimentos Animales, Ministerio de Medio Ambiente y Alimentación de Dinamarca. 1. Irradiación prequirúrgica NOTA: La irradiación previa a la cirugía tiene lugar 7 días antes de la cirugía. Inducir la a…

Representative Results

Este procedimiento se ha utilizado anteriormente en tres experimentos independientes. Todos los experimentos fueron realizados por diferentes investigadores principales que son coautores de este artículo. En los tres experimentos, se tuvo mucho cuidado de adherirse al mismo procedimiento descrito en este protocolo. En los tres experimentos, el linfedema secundario fue inducido en una extremidad posterior, mientras que la otra extremidad posterior sirvió como control. Los volúmenes de l…

Discussion

Hay algunos pasos críticos en este protocolo. En primer lugar, es importante que los investigadores tomen precauciones de seguridad cuando trabajan con radiactividad. En segundo lugar, durante la parte quirúrgica de este protocolo, es importante iniciar el procedimiento una vez anestesiado el ratón y terminarlo sin pausas innecesarias. Esto es importante para evitar un período quirúrgico excesivamente largo para el animal y para evitar que la anestesia pierde efecto durante la cirugía. Se recomienda administrar só…

Materials

10-0 Nylon suture	S&T	12051-10
6-0 Nylon suture – Dafilon	B Braun	C0933112
Coagulator – ICC 50	ERBE
Cotton tipped applicators	Yibon medical co
Dissecting forceps	Lawton	09-0190
Elastic retractors	Odense University Hospital
Electrical clipper	Aesculap	GT420
Fentanyl 0,315 mg/ml	Matrix
Heating pad – PhysioSuite	Kent Scientific Corp.
Isoflurane 1000mg Attane	Scan Vet
Isoflurane vaporizer – PPV	Penlon
Micro jewler forceps	Lawton	1405-05
Micro Needle holder	Lawton	25679-14
Micro scissors	Lawton	10128-15
Micro tying forceps	Lawton	43953-10
Microfine U-40 syringe 0,5ml	BD	328821
Microlance syringe 25g	BD
Microlance syringe 27g	BD
Midazolam 5 mg/ml (hameln)	Matrix
Needle holder – Circle wood	Lawton	08-0065
Non woven swabs	Selefa
Opmi pico microscope F170	Zeiss
Patent blue V – 25 mg/ml	Guerbet
Scissors – Joseph	BD	RH1630
Siemens INVEON multimodality pre-clinical scanner	Siemens pre-clinical solutions
Source of radiation – D3100	Gulmay
Stata Statistical Software: Release 15	StataCorp LLC
Temgesic – 0,2 mg	Indivior
Vet eye ointment – viscotears	Bausch & Lomb