זיהוי של שעתוק מקדם ווסת באמצעות הקרנת תפוקה בינונית של ספריות מסודר וכתבת המבוססת על כפול-לוציפראז
Summary
כדי לזהות והרגולטורים הרומן של גורמי שעתוק, פיתחנו גישה למסך מסודר או לספריות RNAi ויראלי באמצעות שימוש כפול-לוציפראז מבוסס מבוססת הכתב. גישה זו מציעה דרך מהירה וזולה יחסית להקרין מאות מועמדים בניסוי אחד.
Abstract
גורמים שעתוק יכול לשנות את הביטוי של גנים היעד רבים המשפיעים על מגוון של תהליכים במורד הופך אותם מטרות טובות נגד סרטן טיפולים. עם זאת, מיקוד ישירות גורמי שעתוק הוא לעתים קרובות קשה יכול לגרום לתופעות לוואי שליליות אם גורם שעתוק הוא הכרחי ברקמות אחת או יותר מבוגר. זיהוי במעלה והרגולטורים כי באופן מיוחד להפעיל את גורמי התמלול בתאים סרטניים מציע חלופה אפשרית יותר, במיוחד אם אלה חלבונים הם קלים לתרופה. כאן, אנו מתארים פרוטוקול שניתן להשתמש בו כדי לשלב ספריות ויראליות בקנה מידה בינוני ומבוסס כפול-לluciferase מבוססי הכתב לזהות הרגולטורים הרומן של גורמי שעתוק בתאים סרטניים. הגישה שלנו מציעה דרך מהירה, קלה וזולה לבחון מאות גנים בניסוי אחד. כדי להדגים את השימוש בגישה זו, ביצעת מסך של ספריית RNAi ויראלי מסודר המכיל מספר הרגולטורים של חלבון הקשורים כן (לצ) ו transcript co-activator עם מוטיב PDZ-כריכה (TAZ), שני ההמרה שיתוף מפעילי כי הם הזרם המורד של מסלול היפו. עם זאת, גישה זו יכול להיות שונה למסך עבור הרגולטורים של כמעט כל גורם שעתוק או שיתוף פקטור והוא יכול לשמש גם למסך CRISPR/CAS9, cDNA, או ORF ספריות.
Introduction
מטרת השיטה היא להשתמש בספריות ויראליות לזיהוי הרגולטורים של גורמי שעתוק בצורה מהירה וזולה יחסית. הפעילות החריגה מזוהה עם סרטן גרורות1,2,3,4,5,6, כך המיקוד גורמים שעתוק בתאים סרטניים היא גישה טיפולית מבטיחה. עם זאת, גורמים שעתוק הם לעתים קרובות קשה למקד את היעד של השימוש ב-פרמקואובולוגית7 ורבים נדרשים עבור פונקציה סלולרית נורמלית ברקמות למבוגרים8,9,10. מיקוד המסלולים הקשורים לסרטן, כי בדרך מאוד להפעיל גורמי תמלול כדי לנהוג במחלה היא גישה אפשרית יותר עם פוטנציאל יש תופעות לוואי חמורות פחות. הזמינות המסחרית של מערך מסודר ונגיפי RNAi, CRISPR/CAS9, cDNA, או ORF ספריות מאפשר לחוקרים לבדוק את החשיבות של גנים רבים בניסוי אחד. עם זאת, נדרש בדיקה אמינה לפעילות הטרנסדפורמציה ששונתה.
כאן, אנו מתארים את השימוש בשיטת הכתב המבוסס על כפול-לוציפראזה ובספריות מבוססות-ויראליות כדי לזהות חלבונים המסדירים את גורמי התמלול בתאי הסרטן. בתוך מעשה זה, משרין כי היעד הקשורים לסרטן הגנים מועברים לתאי סרטן היונקים באמצעות התמרה ויראלי תאים נבחרים עבור אינטגרציה יציבה באמצעות puromycin. התאים הם הטרנסג הבאה עם מבנה עיתונאי המבטא גחלילית לוציפראז מונע על ידי יזם ספציפי לגורם שעתוק כי הוא נחקר מבנה שליטה המבטא Renilla לוציפראז מיזם פעיל באופן מכונן שאינו מגיב לגורם שעתוק נחקר. אנו מדגימים גישה זו עם מסך הוכחה של קונספט עבור הרגולטורים של לנבוח ו TAZ, המטה הקריטי העריקים של מסלול היפו8,10,11. פעילות חריגה של לנבוח ו TAZ מקדמת מספר שלבים של אשד גרורתי11 והוא נצפה בסרטן רבים11,12,13. עם זאת, כיצד להפוך את באופן מאוד מתאים ל-, מפעיל בתאי סרטן לא מובנים עדיין. במקום זאת, לא לקשור את ה-DNA, אלא מגויס ליזמים על ידי שעתוק אחרים. חברים בתחום התה (TEAD) המשפחה של גורמי שעתוק הם שותפי האיגוד העיקריים ל-לנבוח ו-TAZ, והם קריטיים עבור רוב הפונקציות מתלוות ו TAZ. העיתונאי שלנו לבנות מביע מבטא גחלילית לוציפראז מתוך מיזם לנבוח/TAZ-tead תגובה ומחקרים קודמים הפגינו כי הוא בנאמנות מזהה שינויים ב-2לנבוח-tead ו TAZ-tead פעילותמעבר 2,14,15.
הגישה שלנו היא מהירה, תפוקה בינונית, ואינו דורש מתקני הקרנה, רובוטים אוטומטיים או רצף עמוק של ספריות במאגר. העלויות נמוכות יחסית וקיימות ספריות מסחריות זמינות רבות לבחירה. הציוד הנדרש והריאגנטים הינם גם סטנדרטיים יחסית ברוב המעבדות. זה יכול לשמש למסך עבור הרגולטורים כמעט כל גורם שעתוק אם העיתונאי מבוסס לוציפראז קיים או נוצר. אנו משתמשים בגישה זו כדי להקרין מרין בתאים סרטניים, אבל כל קו תא שניתן לשנות עם יעילות סבירה יכול לשמש עם כל סוג של ספריית מסודר.
Protocol
Representative Results
Discussion
במחקר זה, אנו מדגימים גישה עבור הקרנת תפוקה בינונית של ספריות ויראליות מסודר בשילוב עם שיטת dual-לוציפראז מבוססי הכתב המבוסס שניתן להשתמש כדי לזהות ולבדוק הרגולטורים הרומן של גורמים שעתוק. זה קריטי לאפיין ולייעל את מערכת הכתב עבור כל קו תא לפני כל מסך. יש לעשות ניסויים כדי לוודא כי העיתונאי ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
היינו רוצים להודות לאמילי נורטון ומיקילן קוקצ’רי-סטלירוס על כך שהיא עזרה בהכנת וקטורים מרין. עבודה זו היתה נתמכת בחלקו על ידי המענק סוזן G. Komen Catalyst הוענק J.M.L. (#CCR17477184).
Materials
| 2.0 ml 96-well deep well polypropylene plate | USA Scientific | 1896-2000 | For bacterial mini-prep |
| Trypsin – 2.50% | Gibco | 15090-046 | Component of trypsin-EDTA |
| 96 well flat bottom white assay plate | Corning | 3922 | For dual-luciferase assay |
| Ampicillin – 100 mg/ml | Sigma-Aldrich | 45-10835242001-EA | For bacterial mini-prep |
| Bacto-tryptone – powder | Sigma-Aldrich | 95039 | Component of LB broth |
| Dual-luciferase reporter assay system, which include LAR II reagent (reagent A), Stop & Glo substrate (reagent B substrate) and Stop & Glo buffer (reagent B buffer) – Kit | Promega | E1960 | For dual-luciferase assay |
| Dulbecco's phosphate buffered saline w/o calcium, magnesium and phenol red – 9.6 g/L | Himedia | TS1006 | For PBS |
| EDTA – 0.5 M | VWR | 97061-406 | Component of trypsin-EDTA |
| Ethanol – 100% | Pharmco-AAPER | 111000200 | For bacterial mini-prep |
| Foetal Bovine Serum – 100% | VWR | 97068-085 | Component of complete growth media |
| Hexadimethrine bromide (Polybrene) – 8 mg/ml | Sigma-Aldrich | 45-H9268 | For virus infection |
| HyClone DMEM/High glucose – 4 mM L-Glutamine; 4500 mg/L glucose; sodium pyruvate | GE Healthcare life sciences | SH30243.01 | Component of complete growth media |
| I3-P/i3 Multi-Mode Microplate/EA | Molecular devices | For dual-luciferase assay | |
| L-Glutamine – 200 mM | Gibco | 25030-081 | Component of complete growth media |
| Lipofectamine 3000 (Transfection Reagent 2) – 100% | Life technologies | L3000008 | For transfections |
| Molecular Biology Water – 100% | VWR | 02-0201-0500 | For dilution of shRNA vector for virus packaging |
| NaCl – powder | BDH | BDH9286 | Component of LB broth |
| NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo scientific | For measuring vector DNA concentration | |
| Opti-MEM (Transfection Buffer) – 100% | Gibco | 31985-062 | For transfections |
| Penicillin Streptomycin – 10,000 Unit/ml (Penicillin); 10,000 µg/ml (Streptomycin) | Gibco | 15140-122 | Component of complete growth media |
| PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit – Kit | Thermo Fisher Scientific | K210010 | For bacterial mini-prep |
| Puromycin – 2.5 mg/ml | Sigma-Aldrich | 45-P7255 | For antibiotic selection after infection |
| TC20 automated cell counter | Bio-Rad | For cell counting | |
| X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent (Transfection Reagent 1) – 100% | Roche | 6365787001 | For virus packaging |
| Yeast extract – powder | VWR | J850 | Component of LB broth |
| P3000 (Transfection Reagent 3) – 100% | Life technologies | L3000008 | For transfections |
References
- Chen, K. S., Lim, J. W. C., Richards, L. J., Bunt, J. The convergent roles of the nuclear factor I transcription factors in development and cancer. Cancer Letters. 410, 124-138 (2017).
- Lamar, J. M., et al. The Hippo pathway target, YAP, promotes metastasis through its TEAD-interaction domain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (37), E2441-E2450 (2012).
- Liu, C. Y., Yu, T., Huang, Y., Cui, L., Hong, W. ETS (E26 transformation-specific) up-regulation of the transcriptional co-activator TAZ promotes cell migration and metastasis in prostate cancer. Journal of Biological Chemistry. 292 (22), 9420-9430 (2017).
- Semenza, G. L. Hypoxia-inducible factor 1: oxygen homeostasis and disease pathophysiology. Trends in Molecular Medicine. 7 (8), 345-350 (2001).
- Willmer, T., Cooper, A., Peres, J., Omar, R., Prince, S. The T-Box transcription factor 3 in development and cancer. Bioscience Trends. 11 (3), 254-266 (2017).
- Zhu, C., Li, L., Zhao, B. The regulation and function of YAP transcription co-activator. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 47 (1), 16-28 (2015).
- Dang, C. V., Reddy, E. P., Shokat, K. M., Soucek, L. Drugging the ‘undruggable’ cancer targets. Nature Reviews: Cancer. 17 (8), 502-508 (2017).
- Fu, V., Plouffe, S. W., Guan, K. L. The Hippo pathway in organ development, homeostasis, and regeneration. Current Opinion in Cell Biology. 49, 99-107 (2017).
- Hansen, C. G., Moroishi, T., Guan, K. L. YAP and TAZ: a nexus for Hippo signaling and beyond. Trends in Cell Biology. 25 (9), 499-513 (2015).
- Yu, F. X., Zhao, B., Guan, K. L. Hippo Pathway in Organ Size Control, Tissue Homeostasis, and Cancer. Cell. 163 (4), 811-828 (2015).
- Warren, J. S. A., Xiao, Y., Lamar, J. M. YAP/TAZ Activation as a Target for Treating Metastatic Cancer. Cancers. 10 (4), (2018).
- Janse van Rensburg, H. J., Yang, X. The roles of the Hippo pathway in cancer metastasis. Cellular Signalling. 28 (11), 1761-1772 (2016).
- Zanconato, F., Cordenonsi, M., Piccolo, S. YAP/TAZ at the Roots of Cancer. Cancer Cell. 29 (6), 783-803 (2016).
- Lamar, J. M., et al. SRC tyrosine kinase activates the YAP/TAZ axis and thereby drives tumor growth and metastasis. Journal of Biological Chemistry. 294 (7), 2302-2317 (2019).
- Mahoney, W. M., Hong, J. H., Yaffe, M. B., Farrance, I. K. The transcriptional co-activator TAZ interacts differentially with transcriptional enhancer factor-1 (TEF-1) family members. Biochemical Journal. 388 (Pt 1), 217-225 (2005).
- Codelia, V. A., Sun, G., Irvine, K. D. Regulation of YAP by mechanical strain through Jnk and Hippo signaling. Current Biology. 24 (17), 2012-2017 (2014).
- Cosset, E., et al. Glut3 Addiction Is a Druggable Vulnerability for a Molecularly Defined Subpopulation of Glioblastoma. Cancer Cell. 32 (6), 856-868 (2017).
- de Cristofaro, T., et al. TAZ/WWTR1 is overexpressed in papillary thyroid carcinoma. European Journal of Cancer. 47 (6), 926-933 (2011).
- Densham, R. M., et al. MST kinases monitor actin cytoskeletal integrity and signal via c-Jun N-terminal kinase stress-activated kinase to regulate p21Waf1/Cip1 stability. Molecular and Cellular Biology. 29 (24), 6380-6390 (2009).
- Eda, H., Aoki, K., Marumo, K., Fujii, K., Ohkawa, K. FGF-2 signaling induces downregulation of TAZ protein in osteoblastic MC3T3-E1 cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 366 (2), 471-475 (2008).
- Elbediwy, A., et al. Integrin signalling regulates YAP and TAZ to control skin homeostasis. Development. 143 (10), 1674-1687 (2016).
- Enomoto, M., Igaki, T. Src controls tumorigenesis via JNK-dependent regulation of the Hippo pathway in Drosophila. EMBO Reports. 14 (1), 65-72 (2013).
- Enomoto, M., Kizawa, D., Ohsawa, S., Igaki, T. JNK signaling is converted from anti- to pro-tumor pathway by Ras-mediated switch of Warts activity. 발생학. 403 (2), 162-171 (2015).
- Fan, R., Kim, N. G., Gumbiner, B. M. Regulation of Hippo pathway by mitogenic growth factors via phosphoinositide 3-kinase and phosphoinositide-dependent kinase-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (7), 2569-2574 (2013).
- Feng, R., et al. MAPK and Hippo signaling pathways crosstalk via the RAF-1/MST-2 interaction in malignant melanoma. Oncology Reports. 38 (2), 1199-1205 (2017).
- Fisher, M. L., et al. Transglutaminase Interaction with alpha6/beta4-Integrin Stimulates YAP1-Dependent DeltaNp63alpha Stabilization and Leads to Enhanced Cancer Stem Cell Survival and Tumor Formation. 암 연구학. 76 (24), 7265-7276 (2016).
- Haskins, J. W., Nguyen, D. X., Stern, D. F. Neuregulin 1-activated ERBB4 interacts with YAP to induce Hippo pathway target genes and promote cell migration. Science Signaling. 7 (355), (2014).
- Hoeing, K., et al. Presenilin-1 processing of ErbB4 in fetal type II cells is necessary for control of fetal lung maturation. Biochimica et Biophysica Acta. 1813 (3), 480-491 (2011).
- Hwang, J. H., et al. Extracellular Matrix Stiffness Regulates Osteogenic Differentiation through MAPK Activation. PloS One. 10 (8), e0135519 (2015).
- Kaneko, K., Ito, M., Naoe, Y., Lacy-Hulbert, A., Ikeda, K. Integrin alphav in the mechanical response of osteoblast lineage cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 447 (2), 352-357 (2014).
- Kim, N. G., Gumbiner, B. M. Adhesion to fibronectin regulates Hippo signaling via the FAK-Src-PI3K pathway. Journal of Cell Biology. 210 (3), 503-515 (2015).
- Kuser-Abali, G., Alptekin, A., Cinar, B. Overexpression of MYC and EZH2 cooperates to epigenetically silence MST1 expression. Epigenetics. 9 (4), 634-643 (2014).
- Liu, N., et al. HDM2 Promotes NEDDylation of Hepatitis B Virus HBx To Enhance Its Stability and Function. Journal of Virology. 91 (16), (2017).
- Liu, X., et al. The EZH2- H3K27me3-DNMT1 complex orchestrates epigenetic silencing of the wwc1 gene, a Hippo/YAP pathway upstream effector, in breast cancer epithelial cells. Cellular Signalling. 51, 243-256 (2018).
- Omerovic, J., et al. Ligand-regulated association of ErbB-4 to the transcriptional co-activator YAP65 controls transcription at the nuclear level. Experimental Cell Research. 294 (2), 469-479 (2004).
- Pegoraro, S., et al. A novel HMGA1-CCNE2-YAP axis regulates breast cancer aggressiveness. Oncotarget. 6 (22), 19087-19101 (2015).
- Xia, H., et al. EGFR-PI3K-PDK1 pathway regulates YAP signaling in hepatocellular carcinoma: the mechanism and its implications in targeted therapy. Cell Death & Disease. 9 (3), 269 (2018).
- Yan, F., et al. ErbB4 protects against neuronal apoptosis via activation of YAP/PIK3CB signaling pathway in a rat model of subarachnoid hemorrhage. Experimental Neurology. 297, 92-100 (2017).
- Aragona, M., et al. A mechanical checkpoint controls multicellular growth through YAP/TAZ regulation by actin-processing factors. Cell. 154 (5), 1047-1059 (2013).
- Bonilla, X., et al. Genomic analysis identifies new drivers and progression pathways in skin basal cell carcinoma. Nature Genetics. 48 (4), 398-406 (2016).
- Enger, T. B., et al. The Hippo signaling pathway is required for salivary gland development and its dysregulation is associated with Sjogren’s syndrome. Laboratory Investigation. 93 (11), 1203-1218 (2013).
- Fausti, F., et al. ATM kinase enables the functional axis of YAP, PML and p53 to ameliorate loss of Werner protein-mediated oncogenic senescence. Cell Death and Differentiation. 20 (11), 1498-1509 (2013).
- He, J., et al. Positive regulation of TAZ expression by EBV-LMP1 contributes to cell proliferation and epithelial-mesenchymal transition in nasopharyngeal carcinoma. Oncotarget. 8 (32), 52333-52344 (2017).
- Huang, W., et al. The N-terminal phosphodegron targets TAZ/WWTR1 protein for SCFbeta-TrCP-dependent degradation in response to phosphatidylinositol 3-kinase inhibition. Journal of Biological Chemistry. 287 (31), 26245-26253 (2012).
- Imada, S., et al. Role of Src Family Kinases in Regulation of Intestinal Epithelial Homeostasis. Molecular and Cellular Biology. 36 (22), 2811-2823 (2016).
- Kim, N. G., Koh, E., Chen, X., Gumbiner, B. M. E-cadherin mediates contact inhibition of proliferation through Hippo signaling-pathway components. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (29), 11930-11935 (2011).
- Lai, J. K. H., et al. The Hippo pathway effector Wwtr1 regulates cardiac wall maturation in zebrafish. Development. 145 (10), (2018).
- Li, H., Gumbiner, B. M. Deregulation of the Hippo pathway in mouse mammary stem cells promotes mammary tumorigenesis. Mammalian Genome. 27 (11-12), 556-564 (2016).
- Pefani, D. E., O’Neill, E. Hippo pathway and protection of genome stability in response to DNA damage. The FEBS Journal. 283 (8), 1392-1403 (2016).
- Serrano, I., McDonald, P. C., Lock, F., Muller, W. J., Dedhar, S. Inactivation of the Hippo tumour suppressor pathway by integrin-linked kinase. Nature Communications. 4, 2976 (2013).
- Vlug, E. J., et al. Nuclear localization of the transcriptional coactivator YAP is associated with invasive lobular breast cancer. Cellular Oncology (Dordrecht). 36 (5), 375-384 (2013).
- Xie, Q., et al. YAP/TEAD-mediated transcription controls cellular senescence. 암 연구학. 73 (12), 3615-3624 (2013).
- Yee, K. S., et al. A RASSF1A polymorphism restricts p53/p73 activation and associates with poor survival and accelerated age of onset of soft tissue sarcoma. 암 연구학. 72 (9), 2206-2217 (2012).
- Zhou, Z., et al. Oncogenic Kinase-Induced PKM2 Tyrosine 105 Phosphorylation Converts Nononcogenic PKM2 to a Tumor Promoter and Induces Cancer Stem-like Cells. 암 연구학. 78 (9), 2248-2261 (2018).
- Baker, J. M., Boyce, F. M. High-throughput functional screening using a homemade dual-glow luciferase assay. Journal of Visualized Experiments. (88), (2014).
