Identifizierung von Transkriptionsfaktor-Regulierern mit Medium-Throughput-Screening von Arrayed Libraries und einem Dual-Luciferase-basierten Reporter
Summary
Um neue Regulatoren von Transkriptionsfaktoren zu identifizieren, entwickelten wir einen Ansatz für die Bildschirmanordnung von lentiviralen oder retroviralen RNAi-Bibliotheken unter Verwendung eines auf Dual-Luciferase basierenden Transkriptions-Reporter-Assays. Dieser Ansatz bietet eine schnelle und relativ kostengünstige Möglichkeit, Hunderte von Kandidaten in einem einzigen Experiment zu überprüfen.
Abstract
Transkriptionsfaktoren können die Expression zahlreicher Zielgene verändern, die eine Vielzahl von nachgelagerten Prozessen beeinflussen und sie zu guten Zielen für Krebstherapien machen. Jedoch, direkt auf Transkriptionsfaktoren ist oft schwierig und kann Nebenwirkungen verursachen, wenn der Transkriptionsfaktor in einem oder mehreren erwachsenen Geweben notwendig ist. Die Identifizierung vorgelagerter Regulatoren, die Transkriptionsfaktoren in Krebszellen abnorm aktivieren, bietet eine praktikablere Alternative, insbesondere wenn diese Proteine leicht zu medikamentieren sind. Hier beschreiben wir ein Protokoll, das verwendet werden kann, um arrayed mittelgroße lentivirale Bibliotheken und eine dual-luciferase-basierte Transkriptionsreporter-Assay zu kombinieren, um neue Regulatoren von Transkriptionsfaktoren in Krebszellen zu identifizieren. Unser Ansatz bietet eine schnelle, einfache und kostengünstige Möglichkeit, Hunderte von Genen in einem einzigen Experiment zu testen. Um die Verwendung dieses Ansatzes zu demonstrieren, führten wir einen Bildschirm einer arrayed lentiviralEN RNAi-Bibliothek durch, die mehrere Regulatoren von Yes-associated protein (YAP) und transkriptionskoaktivator mit PDZ-Bindungsmotiv (TAZ) enthält, zwei transkriptionelle Co-Aktivatoren, die die nachgeschalteten Effektoren des Hippo-Signalwegs sind. Dieser Ansatz könnte jedoch geändert werden, um regler für praktisch jeden Transkriptionsfaktor oder Co-Faktor zu überprüfen und könnte auch zum Screenen von CRISPR/CAS9-, cDNA- oder ORF-Bibliotheken verwendet werden.
Introduction
Der Zweck dieses Assays ist es, virale Bibliotheken zu verwenden, um Regulatoren von Transkriptionsfaktoren relativ schnell und kostengünstig zu identifizieren. Aberrante Transkriptionsaktivität ist mit Krebs und Metastasen1,2,3,4,5,6, so Targeting Transkriptionsfaktoren in Krebszellen ist ein vielversprechender therapeutischer Ansatz verbunden. Jedoch, Transkriptionsfaktoren sind oft schwierig, pharmakologisch7 und viele sind für die normale zelluläre Funktion in erwachsenen Geweben8,9,10erforderlich. Die Krebswege, die Abschreibfaktoren zur Krankheitsantrieb aktivieren, ist ein praktikablerer Ansatz mit dem Potenzial, weniger schwere Nebenwirkungen zu haben. Die kommerzielle Verfügbarkeit von arrayierten lentiviralen und retroviralen RNAi-, CRISPR/CAS9-, cDNA- oder ORF-Bibliotheken ermöglicht es Forschern, die Bedeutung zahlreicher Gene in einem einzigen Experiment zu testen. Es ist jedoch eine zuverlässige Auslesung für geänderte Transkriptionsaktivitäten erforderlich.
Hier beschreiben wir die Verwendung eines auf Dual-Luciferase basierenden Transkriptions-Reporter-Assays und arrayed lentiviralen Bibliotheken, um Proteine zu identifizieren, die Transkriptionsfaktoren in Krebszellen regulieren. In diesem Test werden shRNAs, die auf krebsassoziierte Gene abzielen, über lentivirale Transduktion an Säugetierkrebszellen abgegeben und Zellen für eine stabile Integration mit Puromycin ausgewählt. Die Zellen werden als nächstes mit einem Reporterkonstrukt transfiziert, das gnädige Luziferase ausdrückt, die von einem Promotor angetrieben wird, der spezifisch für den Transkriptionsfaktor ist, der untersucht wird, und einem Kontrollkonstrukt, das Renilla luziferase von einem konstitutiven aktiven Promotor ausdrückt, der nicht auf den untersuchten Transkriptionsfaktor reagiert. Wir demonstrieren diesen Ansatz mit einem Proof-of-Concept-Bildschirm für Diebesregler von YAP und TAZ, den kritischen Nachgeschalteten Effektoren des Hippo-Signalwegs8,10,11. Abnormale Aktivität von YAP und TAZ fördert mehrere Schritte der metastasierenden Kaskade11 und wird bei vielen Krebsarten beobachtet11,12,13. Wie YAP und TAZ in einigen Krebszellen abwegig aktiviert werden, ist jedoch noch nicht vollständig geklärt. YAP und TAZ binden keine DNA, sondern werden durch andere Transkriptionsfaktoren an Promoter rekrutiert. Mitglieder der TEA-Domain-Familie (TEAD) der Transkriptionsfaktoren sind die wichtigsten Bindungspartner für YAP und TAZ und für die meisten YAP- und TAZ-abhängigen Funktionen von entscheidender Bedeutung. Unser Reporterkonstrukt drückt Gofagifuifase aus einem YAP/TAZ-TEAD-responsiven Promotor aus und frühere Studien haben gezeigt, dass es Veränderungen in YAP-TEAD und TAZ-TEAD Transkriptionsaktivitätgetreuerkennt 2,14,15.
Unser Ansatz ist schnell, mittlerer Durchsatz und erfordert keine Screening-Einrichtungen, automatisierte Roboter oder eine tiefe Sequenzierung von gepoolten Bibliotheken. Die Kosten sind relativ gering und es gibt zahlreiche kommerziell verfügbare Bibliotheken zur Auswahl. Die erforderlichen Geräte und Reagenzien sind auch in den meisten Laboratorien relativ Standard. Es kann verwendet werden, um für Regulatoren von praktisch jedem Transkriptionsfaktor zu überprüfen, wenn ein luziferase-basierter Reporter existiert oder generiert wird. Wir verwenden diesen Ansatz, um shRNAs in Krebszellen zu überprüfen, aber jede Zelllinie, die mit angemessener Effizienz transfiziert werden kann, könnte mit jeder Art von arrayed Bibliothek verwendet werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dieser Studie zeigen wir einen Ansatz für das Medium-Throughput-Screening von arrayed viralen Bibliotheken in Kombination mit einem auf Dual-Luciferase basierenden Transkriptionsreporter-Assay, der verwendet werden kann, um neuartige Regulatoren von Transkriptionsfaktoren zu identifizieren und zu testen. Es ist wichtig, das Reportersystem für jede Zelllinie vor jedem Bildschirm zu charakterisieren und zu optimieren. Es sollten Experimente durchgeführt werden, um zu bestätigen, dass der Reporter auf die veränderte…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Emily Norton und Mikaelan Cucciarre-Stuligross für die Unterstützung bei der Herstellung von shRNA-Vektoren. Diese Arbeit wurde teilweise von einem Susan G. Komen Career Catalyst Grant unterstützt, der J.M.L. (#CCR17477184) verliehen wurde.
Materials
| 2.0 ml 96-well deep well polypropylene plate | USA Scientific | 1896-2000 | For bacterial mini-prep |
| Trypsin – 2.50% | Gibco | 15090-046 | Component of trypsin-EDTA |
| 96 well flat bottom white assay plate | Corning | 3922 | For dual-luciferase assay |
| Ampicillin – 100 mg/ml | Sigma-Aldrich | 45-10835242001-EA | For bacterial mini-prep |
| Bacto-tryptone – powder | Sigma-Aldrich | 95039 | Component of LB broth |
| Dual-luciferase reporter assay system, which include LAR II reagent (reagent A), Stop & Glo substrate (reagent B substrate) and Stop & Glo buffer (reagent B buffer) – Kit | Promega | E1960 | For dual-luciferase assay |
| Dulbecco's phosphate buffered saline w/o calcium, magnesium and phenol red – 9.6 g/L | Himedia | TS1006 | For PBS |
| EDTA – 0.5 M | VWR | 97061-406 | Component of trypsin-EDTA |
| Ethanol – 100% | Pharmco-AAPER | 111000200 | For bacterial mini-prep |
| Foetal Bovine Serum – 100% | VWR | 97068-085 | Component of complete growth media |
| Hexadimethrine bromide (Polybrene) – 8 mg/ml | Sigma-Aldrich | 45-H9268 | For virus infection |
| HyClone DMEM/High glucose – 4 mM L-Glutamine; 4500 mg/L glucose; sodium pyruvate | GE Healthcare life sciences | SH30243.01 | Component of complete growth media |
| I3-P/i3 Multi-Mode Microplate/EA | Molecular devices | For dual-luciferase assay | |
| L-Glutamine – 200 mM | Gibco | 25030-081 | Component of complete growth media |
| Lipofectamine 3000 (Transfection Reagent 2) – 100% | Life technologies | L3000008 | For transfections |
| Molecular Biology Water – 100% | VWR | 02-0201-0500 | For dilution of shRNA vector for virus packaging |
| NaCl – powder | BDH | BDH9286 | Component of LB broth |
| NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo scientific | For measuring vector DNA concentration | |
| Opti-MEM (Transfection Buffer) – 100% | Gibco | 31985-062 | For transfections |
| Penicillin Streptomycin – 10,000 Unit/ml (Penicillin); 10,000 µg/ml (Streptomycin) | Gibco | 15140-122 | Component of complete growth media |
| PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit – Kit | Thermo Fisher Scientific | K210010 | For bacterial mini-prep |
| Puromycin – 2.5 mg/ml | Sigma-Aldrich | 45-P7255 | For antibiotic selection after infection |
| TC20 automated cell counter | Bio-Rad | For cell counting | |
| X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent (Transfection Reagent 1) – 100% | Roche | 6365787001 | For virus packaging |
| Yeast extract – powder | VWR | J850 | Component of LB broth |
| P3000 (Transfection Reagent 3) – 100% | Life technologies | L3000008 | For transfections |
References
- Chen, K. S., Lim, J. W. C., Richards, L. J., Bunt, J. The convergent roles of the nuclear factor I transcription factors in development and cancer. Cancer Letters. 410, 124-138 (2017).
- Lamar, J. M., et al. The Hippo pathway target, YAP, promotes metastasis through its TEAD-interaction domain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (37), E2441-E2450 (2012).
- Liu, C. Y., Yu, T., Huang, Y., Cui, L., Hong, W. ETS (E26 transformation-specific) up-regulation of the transcriptional co-activator TAZ promotes cell migration and metastasis in prostate cancer. Journal of Biological Chemistry. 292 (22), 9420-9430 (2017).
- Semenza, G. L. Hypoxia-inducible factor 1: oxygen homeostasis and disease pathophysiology. Trends in Molecular Medicine. 7 (8), 345-350 (2001).
- Willmer, T., Cooper, A., Peres, J., Omar, R., Prince, S. The T-Box transcription factor 3 in development and cancer. Bioscience Trends. 11 (3), 254-266 (2017).
- Zhu, C., Li, L., Zhao, B. The regulation and function of YAP transcription co-activator. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 47 (1), 16-28 (2015).
- Dang, C. V., Reddy, E. P., Shokat, K. M., Soucek, L. Drugging the ‘undruggable’ cancer targets. Nature Reviews: Cancer. 17 (8), 502-508 (2017).
- Fu, V., Plouffe, S. W., Guan, K. L. The Hippo pathway in organ development, homeostasis, and regeneration. Current Opinion in Cell Biology. 49, 99-107 (2017).
- Hansen, C. G., Moroishi, T., Guan, K. L. YAP and TAZ: a nexus for Hippo signaling and beyond. Trends in Cell Biology. 25 (9), 499-513 (2015).
- Yu, F. X., Zhao, B., Guan, K. L. Hippo Pathway in Organ Size Control, Tissue Homeostasis, and Cancer. Cell. 163 (4), 811-828 (2015).
- Warren, J. S. A., Xiao, Y., Lamar, J. M. YAP/TAZ Activation as a Target for Treating Metastatic Cancer. Cancers. 10 (4), (2018).
- Janse van Rensburg, H. J., Yang, X. The roles of the Hippo pathway in cancer metastasis. Cellular Signalling. 28 (11), 1761-1772 (2016).
- Zanconato, F., Cordenonsi, M., Piccolo, S. YAP/TAZ at the Roots of Cancer. Cancer Cell. 29 (6), 783-803 (2016).
- Lamar, J. M., et al. SRC tyrosine kinase activates the YAP/TAZ axis and thereby drives tumor growth and metastasis. Journal of Biological Chemistry. 294 (7), 2302-2317 (2019).
- Mahoney, W. M., Hong, J. H., Yaffe, M. B., Farrance, I. K. The transcriptional co-activator TAZ interacts differentially with transcriptional enhancer factor-1 (TEF-1) family members. Biochemical Journal. 388 (Pt 1), 217-225 (2005).
- Codelia, V. A., Sun, G., Irvine, K. D. Regulation of YAP by mechanical strain through Jnk and Hippo signaling. Current Biology. 24 (17), 2012-2017 (2014).
- Cosset, E., et al. Glut3 Addiction Is a Druggable Vulnerability for a Molecularly Defined Subpopulation of Glioblastoma. Cancer Cell. 32 (6), 856-868 (2017).
- de Cristofaro, T., et al. TAZ/WWTR1 is overexpressed in papillary thyroid carcinoma. European Journal of Cancer. 47 (6), 926-933 (2011).
- Densham, R. M., et al. MST kinases monitor actin cytoskeletal integrity and signal via c-Jun N-terminal kinase stress-activated kinase to regulate p21Waf1/Cip1 stability. Molecular and Cellular Biology. 29 (24), 6380-6390 (2009).
- Eda, H., Aoki, K., Marumo, K., Fujii, K., Ohkawa, K. FGF-2 signaling induces downregulation of TAZ protein in osteoblastic MC3T3-E1 cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 366 (2), 471-475 (2008).
- Elbediwy, A., et al. Integrin signalling regulates YAP and TAZ to control skin homeostasis. Development. 143 (10), 1674-1687 (2016).
- Enomoto, M., Igaki, T. Src controls tumorigenesis via JNK-dependent regulation of the Hippo pathway in Drosophila. EMBO Reports. 14 (1), 65-72 (2013).
- Enomoto, M., Kizawa, D., Ohsawa, S., Igaki, T. JNK signaling is converted from anti- to pro-tumor pathway by Ras-mediated switch of Warts activity. 발생학. 403 (2), 162-171 (2015).
- Fan, R., Kim, N. G., Gumbiner, B. M. Regulation of Hippo pathway by mitogenic growth factors via phosphoinositide 3-kinase and phosphoinositide-dependent kinase-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (7), 2569-2574 (2013).
- Feng, R., et al. MAPK and Hippo signaling pathways crosstalk via the RAF-1/MST-2 interaction in malignant melanoma. Oncology Reports. 38 (2), 1199-1205 (2017).
- Fisher, M. L., et al. Transglutaminase Interaction with alpha6/beta4-Integrin Stimulates YAP1-Dependent DeltaNp63alpha Stabilization and Leads to Enhanced Cancer Stem Cell Survival and Tumor Formation. 암 연구학. 76 (24), 7265-7276 (2016).
- Haskins, J. W., Nguyen, D. X., Stern, D. F. Neuregulin 1-activated ERBB4 interacts with YAP to induce Hippo pathway target genes and promote cell migration. Science Signaling. 7 (355), (2014).
- Hoeing, K., et al. Presenilin-1 processing of ErbB4 in fetal type II cells is necessary for control of fetal lung maturation. Biochimica et Biophysica Acta. 1813 (3), 480-491 (2011).
- Hwang, J. H., et al. Extracellular Matrix Stiffness Regulates Osteogenic Differentiation through MAPK Activation. PloS One. 10 (8), e0135519 (2015).
- Kaneko, K., Ito, M., Naoe, Y., Lacy-Hulbert, A., Ikeda, K. Integrin alphav in the mechanical response of osteoblast lineage cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 447 (2), 352-357 (2014).
- Kim, N. G., Gumbiner, B. M. Adhesion to fibronectin regulates Hippo signaling via the FAK-Src-PI3K pathway. Journal of Cell Biology. 210 (3), 503-515 (2015).
- Kuser-Abali, G., Alptekin, A., Cinar, B. Overexpression of MYC and EZH2 cooperates to epigenetically silence MST1 expression. Epigenetics. 9 (4), 634-643 (2014).
- Liu, N., et al. HDM2 Promotes NEDDylation of Hepatitis B Virus HBx To Enhance Its Stability and Function. Journal of Virology. 91 (16), (2017).
- Liu, X., et al. The EZH2- H3K27me3-DNMT1 complex orchestrates epigenetic silencing of the wwc1 gene, a Hippo/YAP pathway upstream effector, in breast cancer epithelial cells. Cellular Signalling. 51, 243-256 (2018).
- Omerovic, J., et al. Ligand-regulated association of ErbB-4 to the transcriptional co-activator YAP65 controls transcription at the nuclear level. Experimental Cell Research. 294 (2), 469-479 (2004).
- Pegoraro, S., et al. A novel HMGA1-CCNE2-YAP axis regulates breast cancer aggressiveness. Oncotarget. 6 (22), 19087-19101 (2015).
- Xia, H., et al. EGFR-PI3K-PDK1 pathway regulates YAP signaling in hepatocellular carcinoma: the mechanism and its implications in targeted therapy. Cell Death & Disease. 9 (3), 269 (2018).
- Yan, F., et al. ErbB4 protects against neuronal apoptosis via activation of YAP/PIK3CB signaling pathway in a rat model of subarachnoid hemorrhage. Experimental Neurology. 297, 92-100 (2017).
- Aragona, M., et al. A mechanical checkpoint controls multicellular growth through YAP/TAZ regulation by actin-processing factors. Cell. 154 (5), 1047-1059 (2013).
- Bonilla, X., et al. Genomic analysis identifies new drivers and progression pathways in skin basal cell carcinoma. Nature Genetics. 48 (4), 398-406 (2016).
- Enger, T. B., et al. The Hippo signaling pathway is required for salivary gland development and its dysregulation is associated with Sjogren’s syndrome. Laboratory Investigation. 93 (11), 1203-1218 (2013).
- Fausti, F., et al. ATM kinase enables the functional axis of YAP, PML and p53 to ameliorate loss of Werner protein-mediated oncogenic senescence. Cell Death and Differentiation. 20 (11), 1498-1509 (2013).
- He, J., et al. Positive regulation of TAZ expression by EBV-LMP1 contributes to cell proliferation and epithelial-mesenchymal transition in nasopharyngeal carcinoma. Oncotarget. 8 (32), 52333-52344 (2017).
- Huang, W., et al. The N-terminal phosphodegron targets TAZ/WWTR1 protein for SCFbeta-TrCP-dependent degradation in response to phosphatidylinositol 3-kinase inhibition. Journal of Biological Chemistry. 287 (31), 26245-26253 (2012).
- Imada, S., et al. Role of Src Family Kinases in Regulation of Intestinal Epithelial Homeostasis. Molecular and Cellular Biology. 36 (22), 2811-2823 (2016).
- Kim, N. G., Koh, E., Chen, X., Gumbiner, B. M. E-cadherin mediates contact inhibition of proliferation through Hippo signaling-pathway components. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (29), 11930-11935 (2011).
- Lai, J. K. H., et al. The Hippo pathway effector Wwtr1 regulates cardiac wall maturation in zebrafish. Development. 145 (10), (2018).
- Li, H., Gumbiner, B. M. Deregulation of the Hippo pathway in mouse mammary stem cells promotes mammary tumorigenesis. Mammalian Genome. 27 (11-12), 556-564 (2016).
- Pefani, D. E., O’Neill, E. Hippo pathway and protection of genome stability in response to DNA damage. The FEBS Journal. 283 (8), 1392-1403 (2016).
- Serrano, I., McDonald, P. C., Lock, F., Muller, W. J., Dedhar, S. Inactivation of the Hippo tumour suppressor pathway by integrin-linked kinase. Nature Communications. 4, 2976 (2013).
- Vlug, E. J., et al. Nuclear localization of the transcriptional coactivator YAP is associated with invasive lobular breast cancer. Cellular Oncology (Dordrecht). 36 (5), 375-384 (2013).
- Xie, Q., et al. YAP/TEAD-mediated transcription controls cellular senescence. 암 연구학. 73 (12), 3615-3624 (2013).
- Yee, K. S., et al. A RASSF1A polymorphism restricts p53/p73 activation and associates with poor survival and accelerated age of onset of soft tissue sarcoma. 암 연구학. 72 (9), 2206-2217 (2012).
- Zhou, Z., et al. Oncogenic Kinase-Induced PKM2 Tyrosine 105 Phosphorylation Converts Nononcogenic PKM2 to a Tumor Promoter and Induces Cancer Stem-like Cells. 암 연구학. 78 (9), 2248-2261 (2018).
- Baker, J. M., Boyce, F. M. High-throughput functional screening using a homemade dual-glow luciferase assay. Journal of Visualized Experiments. (88), (2014).
