JoVE Journal > Cancer Research
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
암 연구학

Dizili Kütüphanelerin Orta İşleç Lik Taraması ve Çift Luciferase Tabanlı Muhabir kullanılarak Transkripsiyon Faktörü Düzenleyicilerin Tanımlanması

Published: March 27, 2020
doi:
10.3791/60582
,
1Department of Molecular & Cellular Physiology,Albany Medical College

Summary

Transkripsiyon faktörlerinin yeni düzenleyicilerini belirlemek için, çift luciferase tabanlı transkripsiyonel muhabir testi kullanarak dizili lentiviral veya retroviral RNAi kitaplıklarını taramak için bir yaklaşım geliştirdik. Bu yaklaşım, tek bir deneyde yüzlerce adayı taramak için hızlı ve nispeten ucuz bir yol sunar.

Abstract

Transkripsiyon faktörleri onları anti-kanser tedavileri için iyi hedefler haline downstream süreçlerin çeşitli etkileyen çok sayıda hedef genlerin ekspresyonu değiştirebilirsiniz. Ancak, transkripsiyon faktörlerinin doğrudan hedef alınması genellikle zordur ve bir veya daha fazla erişkin dokuda transkripsiyon faktörü gerekliyse yan etkilere neden olabilir. Bu proteinlerin ilaçlanması kolaysa, kanser hücrelerindeki transkripsiyon faktörlerini anormal bir şekilde aktive eden upstream regülatörlerinin belirlenmesi daha uygulanabilir bir alternatif sunar. Burada, dizili orta ölçekli lentiviral kütüphaneleri birleştirmek için kullanılabilecek bir protokol ve kanser hücrelerindeki transkripsiyon faktörlerinin yeni düzenleyicileri belirlemek için çift luciferase tabanlı transkripsiyonel muhabir test açıklar. Yaklaşımımız, yüzlerce geni tek bir deneyde test etmek için hızlı, kolay ve ucuz bir yol sunar. Bu yaklaşımın kullanımını göstermek için, Hippo yolunun alt etkileri olan iki transkripsiyonel koaktivatörler olan PDZ bağlayıcı motifli (TAZ) ile Evet ilişkili protein (YAP) ve transkripsiyonel koaktivatörün çeşitli düzenleyicileri içeren dizili lentiviral RNAi kütüphanesinin bir ekranını gerçekleştirdik. Ancak, bu yaklaşım hemen hemen herhangi bir transkripsiyon faktörü veya co-faktör düzenleyiciler için ekrana değiştirilebilir ve aynı zamanda CRISPR/CAS9, cDNA veya ORF kitaplıklarını taramak için de kullanılabilir.

Introduction

Bu takınç amacı nispeten hızlı ve ucuz bir şekilde transkripsiyon faktörlerinin düzenleyicileri belirlemek için viral kütüphaneler kullanmaktır. Anormal transkripsiyonel aktivite kanser ve metastaz ile ilişkili1,2,3,4,5,6,bu yüzden kanser hücrelerinde transkripsiyon faktörleri hedefleme umut verici bir tedavi yaklaşımıdır. Ancak, transkripsiyon faktörleri genellikle farmakolojikolarak 7 hedef zordur ve birçok yetişkin dokularda normal hücresel fonksiyon için gereklidir8,9,10. Anormal hastalığı sürücü transkripsiyon faktörleri etkinleştirmek kanser ile ilişkili yolları hedefleme daha az şiddetli yan etkilere sahip potansiyeli ile daha uygulanabilir bir yaklaşımdır. Dizili lentiviral ve retroviral RNAi, CRISPR/CAS9, cDNA veya ORF kütüphanelerinin ticari kullanılabilirliği, araştırmacıların tek bir deneyde çok sayıda genin önemini test etmesine olanak tanır. Ancak, değiştirilmiş transkripsiyonel etkinlik için güvenilir bir okuma gereklidir.

Burada, kanser hücrelerindeki transkripsiyon faktörlerini düzenleyen proteinleri tanımlamak için çift luciferase tabanlı transkripsiyonel muhabir testin ve dizili lentiviral kütüphanelerin kullanımını tanımlıyoruz. Bu araştırmada, kanserle ilişkili genleri hedef alan shRNA’lar lentiviral transdüksiyon yoluyla memeli kanser hücrelerine ulaştırılır ve hücreler puromisin kullanılarak kararlı entegrasyon için seçilir. Hücreler sonraki araştırılmaktadır transkripsiyon faktörü ne özgü bir organizatör tarafından yönlendirilen firefly luciferase ve araştırılan transkripsiyon faktörü yanıt vermeyen bir kurucu aktif organizatörü renilla luciferase ifade eden bir kontrol yapısı tarafından yönlendirilen firefly luciferase ifade eden bir muhabir yapısı ile transfeced vardır. Biz YAP ve TAZ düzenleyicileri için bir proof-of-concept ekran ile bu yaklaşımı göstermek, Hippo yolukritikdownstream efektörleri 8,10,11. YAP ve TAZ anormal aktivite metastatik basamak birkaç adım teşvik11 ve birçok kanserlerde gözlenen11,12,13. Ancak, YAP ve TAZ’ın bazı kanser hücrelerinde nasıl anormal bir şekilde aktive olduğu henüz tam olarak anlaşılamamıştır. YAP ve TAZ DNA’yı bağlamaz, ancak bunun yerine diğer transkripsiyon faktörleri tarafından organizatörlere istihdam edilir. ÇAY etki alanı (TEAD) transkripsiyon faktörleri ailesinin üyeleri YAP ve TAZ için en önemli bağlayıcı ortaklardır ve çoğu YAP ve TAZ’a bağımlı fonksiyonlar için kritik öneme sahiptir. Muhabirimiz yapı bir YAP/TAZ-TEAD duyarlı organizatörü nden firefly luciferase ifade eder ve önceki çalışmalar da sadakatle YAP-TEAD ve TAZ-TEAD transkripsiyonel aktivite2,,14,15değişiklikleri algılar göstermiştir .

Yaklaşımımız hızlı, orta iş lenmedir ve tarama tesisleri, otomatik robotlar veya havuzlu kütüphanelerin derin sıralamasını gerektirmez. Maliyetler nispeten düşüktür ve aralarından seçim yapabileceğiniz çok sayıda ticari kütüphane vardır. Gerekli ekipman ve reaktifler de çoğu laboratuvarda nispeten standart. Luciferase tabanlı bir muhabir varsa veya oluşturulursa hemen hemen her transkripsiyon faktörü düzenleyicileri için ekran için kullanılabilir. Bu yaklaşımı kanser hücrelerinde shRNA’ları taramak için kullanıyoruz, ancak makul bir verimlilikle aktarılabilen herhangi bir hücre hattı, her türlü dizili kütüphanede kullanılabilir.

Protocol

NOT: Bu protokolün şematik bir özeti Şekil 1’degösterilmiştir. 1. Lentiviral vektör kütüphane hazırlama NOT: Gösterilen ekran 96-iyi plakalar gliserol stokları olarak satın alınan bir dizili shRNA kütüphane kullanılan, ancak kütüphaneler de adayların bir listesine göre el ile monte edilebilir. Uygun denetimler dikkate alınmalı ve herhangi bir kitaplıkta yer almalıdır. Buna, hedefsiz bir kontrol shRNA (shNTC), tra…

Representative Results

Bizim YAP / TAZ-TEAD muhabir yapısı (pGL3-5xMCAT (SV)-492,14,15) kanonik TEAD bağlayıcı elemanı (MCAT)15 ateşböceği luciferase gen sürüş 5 tekrarları ile minimal Bir SV-49 organizatörü içerir ( Şekil1). Constitutively aktif HSV TK organizatörü renilla luciferase ifade PRL-TK kontrol vektörü (Promega) ile birlikte …

Discussion

Bu çalışmada, transkripsiyon faktörlerinin yeni düzenleyicilerini tanımlamak ve test etmek için kullanılabilecek çift luciferase tabanlı transkripsiyonel muhabir testi ile birlikte dizili viral kütüphanelerin orta iş bölümü taraması için bir yaklaşım gösterilmiştir. Herhangi bir ekrandan önce her hücre hattı için muhabir sistemini karakterize etmek ve optimize etmek çok önemlidir. Muhabirin incelenmekte olan transkripsiyon faktörünün değiştirilmiş aktivitesine duyarlı olduğunu doğrula…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Emily Norton ve Mikaelan Cucciarre-Stuligross’a shRNA vektörlerinin hazırlanmasına yardımcı olan için teşekkür ederiz. Bu çalışma kısmen J.M.L.’ye (#CCR17477184) verilen Susan G. Komen Career Catalyst Grant tarafından desteklenmiştir.

Materials

2.0 ml 96-well deep well polypropylene plate USA Scientific 1896-2000 For bacterial mini-prep
Trypsin – 2.50% Gibco 15090-046 Component of trypsin-EDTA
96 well flat bottom white assay plate Corning 3922 For dual-luciferase assay
Ampicillin – 100 mg/ml Sigma-Aldrich 45-10835242001-EA For bacterial mini-prep
Bacto-tryptone – powder Sigma-Aldrich 95039 Component of LB broth
Dual-luciferase reporter assay system, which include LAR II reagent (reagent A), Stop & Glo substrate (reagent B substrate) and Stop & Glo buffer (reagent B buffer) – Kit Promega E1960 For dual-luciferase assay
Dulbecco's phosphate buffered saline w/o calcium, magnesium and phenol red – 9.6 g/L Himedia TS1006 For PBS
EDTA – 0.5 M VWR 97061-406 Component of trypsin-EDTA
Ethanol – 100% Pharmco-AAPER 111000200 For bacterial mini-prep
Foetal Bovine Serum – 100% VWR 97068-085 Component of complete growth media
Hexadimethrine bromide (Polybrene) – 8 mg/ml Sigma-Aldrich 45-H9268 For virus infection
HyClone DMEM/High glucose – 4 mM L-Glutamine; 4500 mg/L glucose; sodium pyruvate GE Healthcare life sciences SH30243.01 Component of complete growth media
I3-P/i3 Multi-Mode Microplate/EA Molecular devices For dual-luciferase assay
L-Glutamine – 200 mM Gibco 25030-081 Component of complete growth media
Lipofectamine 3000 (Transfection Reagent 2) – 100% Life technologies L3000008 For transfections
Molecular Biology Water – 100% VWR 02-0201-0500 For dilution of shRNA vector for virus packaging
NaCl – powder BDH BDH9286 Component of LB broth
NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer Thermo scientific For measuring vector DNA concentration
Opti-MEM (Transfection Buffer) – 100% Gibco 31985-062 For transfections
Penicillin Streptomycin – 10,000 Unit/ml (Penicillin); 10,000 µg/ml (Streptomycin) Gibco 15140-122 Component of complete growth media
PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit – Kit Thermo Fisher Scientific K210010 For bacterial mini-prep
Puromycin – 2.5 mg/ml Sigma-Aldrich 45-P7255 For antibiotic selection after infection
TC20 automated cell counter Bio-Rad For cell counting
X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent (Transfection Reagent 1) – 100% Roche 6365787001 For virus packaging
Yeast extract – powder VWR J850 Component of LB broth
P3000 (Transfection Reagent 3) – 100% Life technologies L3000008 For transfections
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chen, K. S., Lim, J. W. C., Richards, L. J., Bunt, J. The convergent roles of the nuclear factor I transcription factors in development and cancer. Cancer Letters. 410, 124-138 (2017).
  2. Lamar, J. M., et al. The Hippo pathway target, YAP, promotes metastasis through its TEAD-interaction domain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (37), E2441-E2450 (2012).
  3. Liu, C. Y., Yu, T., Huang, Y., Cui, L., Hong, W. ETS (E26 transformation-specific) up-regulation of the transcriptional co-activator TAZ promotes cell migration and metastasis in prostate cancer. Journal of Biological Chemistry. 292 (22), 9420-9430 (2017).
  4. Semenza, G. L. Hypoxia-inducible factor 1: oxygen homeostasis and disease pathophysiology. Trends in Molecular Medicine. 7 (8), 345-350 (2001).
  5. Willmer, T., Cooper, A., Peres, J., Omar, R., Prince, S. The T-Box transcription factor 3 in development and cancer. Bioscience Trends. 11 (3), 254-266 (2017).
  6. Zhu, C., Li, L., Zhao, B. The regulation and function of YAP transcription co-activator. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 47 (1), 16-28 (2015).
  7. Dang, C. V., Reddy, E. P., Shokat, K. M., Soucek, L. Drugging the ‘undruggable’ cancer targets. Nature Reviews: Cancer. 17 (8), 502-508 (2017).
  8. Fu, V., Plouffe, S. W., Guan, K. L. The Hippo pathway in organ development, homeostasis, and regeneration. Current Opinion in Cell Biology. 49, 99-107 (2017).
  9. Hansen, C. G., Moroishi, T., Guan, K. L. YAP and TAZ: a nexus for Hippo signaling and beyond. Trends in Cell Biology. 25 (9), 499-513 (2015).
  10. Yu, F. X., Zhao, B., Guan, K. L. Hippo Pathway in Organ Size Control, Tissue Homeostasis, and Cancer. Cell. 163 (4), 811-828 (2015).
  11. Warren, J. S. A., Xiao, Y., Lamar, J. M. YAP/TAZ Activation as a Target for Treating Metastatic Cancer. Cancers. 10 (4), (2018).
  12. Janse van Rensburg, H. J., Yang, X. The roles of the Hippo pathway in cancer metastasis. Cellular Signalling. 28 (11), 1761-1772 (2016).
  13. Zanconato, F., Cordenonsi, M., Piccolo, S. YAP/TAZ at the Roots of Cancer. Cancer Cell. 29 (6), 783-803 (2016).
  14. Lamar, J. M., et al. SRC tyrosine kinase activates the YAP/TAZ axis and thereby drives tumor growth and metastasis. Journal of Biological Chemistry. 294 (7), 2302-2317 (2019).
  15. Mahoney, W. M., Hong, J. H., Yaffe, M. B., Farrance, I. K. The transcriptional co-activator TAZ interacts differentially with transcriptional enhancer factor-1 (TEF-1) family members. Biochemical Journal. 388 (Pt 1), 217-225 (2005).
  16. Codelia, V. A., Sun, G., Irvine, K. D. Regulation of YAP by mechanical strain through Jnk and Hippo signaling. Current Biology. 24 (17), 2012-2017 (2014).
  17. Cosset, E., et al. Glut3 Addiction Is a Druggable Vulnerability for a Molecularly Defined Subpopulation of Glioblastoma. Cancer Cell. 32 (6), 856-868 (2017).
  18. de Cristofaro, T., et al. TAZ/WWTR1 is overexpressed in papillary thyroid carcinoma. European Journal of Cancer. 47 (6), 926-933 (2011).
  19. Densham, R. M., et al. MST kinases monitor actin cytoskeletal integrity and signal via c-Jun N-terminal kinase stress-activated kinase to regulate p21Waf1/Cip1 stability. Molecular and Cellular Biology. 29 (24), 6380-6390 (2009).
  20. Eda, H., Aoki, K., Marumo, K., Fujii, K., Ohkawa, K. FGF-2 signaling induces downregulation of TAZ protein in osteoblastic MC3T3-E1 cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 366 (2), 471-475 (2008).
  21. Elbediwy, A., et al. Integrin signalling regulates YAP and TAZ to control skin homeostasis. Development. 143 (10), 1674-1687 (2016).
  22. Enomoto, M., Igaki, T. Src controls tumorigenesis via JNK-dependent regulation of the Hippo pathway in Drosophila. EMBO Reports. 14 (1), 65-72 (2013).
  23. Enomoto, M., Kizawa, D., Ohsawa, S., Igaki, T. JNK signaling is converted from anti- to pro-tumor pathway by Ras-mediated switch of Warts activity. 발생학. 403 (2), 162-171 (2015).
  24. Fan, R., Kim, N. G., Gumbiner, B. M. Regulation of Hippo pathway by mitogenic growth factors via phosphoinositide 3-kinase and phosphoinositide-dependent kinase-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (7), 2569-2574 (2013).
  25. Feng, R., et al. MAPK and Hippo signaling pathways crosstalk via the RAF-1/MST-2 interaction in malignant melanoma. Oncology Reports. 38 (2), 1199-1205 (2017).
  26. Fisher, M. L., et al. Transglutaminase Interaction with alpha6/beta4-Integrin Stimulates YAP1-Dependent DeltaNp63alpha Stabilization and Leads to Enhanced Cancer Stem Cell Survival and Tumor Formation. 암 연구학. 76 (24), 7265-7276 (2016).
  27. Haskins, J. W., Nguyen, D. X., Stern, D. F. Neuregulin 1-activated ERBB4 interacts with YAP to induce Hippo pathway target genes and promote cell migration. Science Signaling. 7 (355), (2014).
  28. Hoeing, K., et al. Presenilin-1 processing of ErbB4 in fetal type II cells is necessary for control of fetal lung maturation. Biochimica et Biophysica Acta. 1813 (3), 480-491 (2011).
  29. Hwang, J. H., et al. Extracellular Matrix Stiffness Regulates Osteogenic Differentiation through MAPK Activation. PloS One. 10 (8), e0135519 (2015).
  30. Kaneko, K., Ito, M., Naoe, Y., Lacy-Hulbert, A., Ikeda, K. Integrin alphav in the mechanical response of osteoblast lineage cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 447 (2), 352-357 (2014).
  31. Kim, N. G., Gumbiner, B. M. Adhesion to fibronectin regulates Hippo signaling via the FAK-Src-PI3K pathway. Journal of Cell Biology. 210 (3), 503-515 (2015).
  32. Kuser-Abali, G., Alptekin, A., Cinar, B. Overexpression of MYC and EZH2 cooperates to epigenetically silence MST1 expression. Epigenetics. 9 (4), 634-643 (2014).
  33. Liu, N., et al. HDM2 Promotes NEDDylation of Hepatitis B Virus HBx To Enhance Its Stability and Function. Journal of Virology. 91 (16), (2017).
  34. Liu, X., et al. The EZH2- H3K27me3-DNMT1 complex orchestrates epigenetic silencing of the wwc1 gene, a Hippo/YAP pathway upstream effector, in breast cancer epithelial cells. Cellular Signalling. 51, 243-256 (2018).
  35. Omerovic, J., et al. Ligand-regulated association of ErbB-4 to the transcriptional co-activator YAP65 controls transcription at the nuclear level. Experimental Cell Research. 294 (2), 469-479 (2004).
  36. Pegoraro, S., et al. A novel HMGA1-CCNE2-YAP axis regulates breast cancer aggressiveness. Oncotarget. 6 (22), 19087-19101 (2015).
  37. Xia, H., et al. EGFR-PI3K-PDK1 pathway regulates YAP signaling in hepatocellular carcinoma: the mechanism and its implications in targeted therapy. Cell Death & Disease. 9 (3), 269 (2018).
  38. Yan, F., et al. ErbB4 protects against neuronal apoptosis via activation of YAP/PIK3CB signaling pathway in a rat model of subarachnoid hemorrhage. Experimental Neurology. 297, 92-100 (2017).
  39. Aragona, M., et al. A mechanical checkpoint controls multicellular growth through YAP/TAZ regulation by actin-processing factors. Cell. 154 (5), 1047-1059 (2013).
  40. Bonilla, X., et al. Genomic analysis identifies new drivers and progression pathways in skin basal cell carcinoma. Nature Genetics. 48 (4), 398-406 (2016).
  41. Enger, T. B., et al. The Hippo signaling pathway is required for salivary gland development and its dysregulation is associated with Sjogren’s syndrome. Laboratory Investigation. 93 (11), 1203-1218 (2013).
  42. Fausti, F., et al. ATM kinase enables the functional axis of YAP, PML and p53 to ameliorate loss of Werner protein-mediated oncogenic senescence. Cell Death and Differentiation. 20 (11), 1498-1509 (2013).
  43. He, J., et al. Positive regulation of TAZ expression by EBV-LMP1 contributes to cell proliferation and epithelial-mesenchymal transition in nasopharyngeal carcinoma. Oncotarget. 8 (32), 52333-52344 (2017).
  44. Huang, W., et al. The N-terminal phosphodegron targets TAZ/WWTR1 protein for SCFbeta-TrCP-dependent degradation in response to phosphatidylinositol 3-kinase inhibition. Journal of Biological Chemistry. 287 (31), 26245-26253 (2012).
  45. Imada, S., et al. Role of Src Family Kinases in Regulation of Intestinal Epithelial Homeostasis. Molecular and Cellular Biology. 36 (22), 2811-2823 (2016).
  46. Kim, N. G., Koh, E., Chen, X., Gumbiner, B. M. E-cadherin mediates contact inhibition of proliferation through Hippo signaling-pathway components. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (29), 11930-11935 (2011).
  47. Lai, J. K. H., et al. The Hippo pathway effector Wwtr1 regulates cardiac wall maturation in zebrafish. Development. 145 (10), (2018).
  48. Li, H., Gumbiner, B. M. Deregulation of the Hippo pathway in mouse mammary stem cells promotes mammary tumorigenesis. Mammalian Genome. 27 (11-12), 556-564 (2016).
  49. Pefani, D. E., O’Neill, E. Hippo pathway and protection of genome stability in response to DNA damage. The FEBS Journal. 283 (8), 1392-1403 (2016).
  50. Serrano, I., McDonald, P. C., Lock, F., Muller, W. J., Dedhar, S. Inactivation of the Hippo tumour suppressor pathway by integrin-linked kinase. Nature Communications. 4, 2976 (2013).
  51. Vlug, E. J., et al. Nuclear localization of the transcriptional coactivator YAP is associated with invasive lobular breast cancer. Cellular Oncology (Dordrecht). 36 (5), 375-384 (2013).
  52. Xie, Q., et al. YAP/TEAD-mediated transcription controls cellular senescence. 암 연구학. 73 (12), 3615-3624 (2013).
  53. Yee, K. S., et al. A RASSF1A polymorphism restricts p53/p73 activation and associates with poor survival and accelerated age of onset of soft tissue sarcoma. 암 연구학. 72 (9), 2206-2217 (2012).
  54. Zhou, Z., et al. Oncogenic Kinase-Induced PKM2 Tyrosine 105 Phosphorylation Converts Nononcogenic PKM2 to a Tumor Promoter and Induces Cancer Stem-like Cells. 암 연구학. 78 (9), 2248-2261 (2018).
  55. Baker, J. M., Boyce, F. M. High-throughput functional screening using a homemade dual-glow luciferase assay. Journal of Visualized Experiments. (88), (2014).

Tags

Keywords: Transcription FactorMedium-throughput ScreeningArrayed LibrariesDual-luciferase ReporterLentiviral VectorRetroviral AssayBacterial Miniprep293FT CellsTransfectionPsPAX2VSVGCell Culture
check_url/kr/60582?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Xiao, Y., Lamar, J. M. Identification of Transcription Factor Regulators using Medium-Throughput Screening of Arrayed Libraries and a Dual-Luciferase-Based Reporter. J. Vis. Exp. (157), e60582, doi:10.3791/60582 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image