미세 유체 및 밀리유체 설정 내에서 광용해로 동적 화학 적 경관의 생성을위한 프로토콜이 제시된다. 이 방법론은 운동성 행동, 영양소 섭취 또는 미생물의 화학 물질에 대한 적응을 포함한 다양한 생물학적 과정을 단일 세포 및 집단 수준에서 연구하는 데 적합합니다.
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이 논문에서
요약
초록
우리는 미생물 화학 변균 실험을위한 마이크로 환경을 만들기 위해 지역화 된 화학 력체가 마이크로 스케일에서 갑자기 사용할 수있는 제어 되고 역동적 인 화학 펄스의 생성 방법을 보여줍니다. 화학 적 펄스를 만들기 위해, 우리는 세균 현탁액을 포함하는 다디메틸실록산 (PDMS) 미세 유체 챔버 내에서 케이지 된 아미노산의 광분해에 의해 거의 즉각적으로 아미노산 소스를 소개하는 시스템을 개발했습니다. 우리는 비디오 현미경 검사법에 의해 추적되는 동안 적극적으로 이러한 동적 화학 그라데이션을 등반 할 수있는 화학 박테리아, Vibrio ordalii에이방법을 적용했습니다. 광이동식 보호기와 화학적 변형에 의해 생물학적으로 불활성('케이지')으로 렌더링된 아미노산은 현탁액에 균일하게 존재하지만, UV-A에 가까운 LED 빔을 통해 사용자가 정의한 시간과 공간에서 발생하는 갑작스런 방출까지 는 소비할 수 없습니다. 펄스에서 방출되는 분자의 수는 노출 시간과 분획 해제 분획 사이의 교정 관계에 의해 결정될 수 있으며, 여기서 광용해 후 흡수 스펙트럼은 UV-Vis 분광법을 사용하는 것이 특징입니다. 나노다공성 폴리카보네이트(PCTE) 멤브레인은 미유체 장치로 통합되어 미주된 화합물 및 소비된 매체의 흐름에 의해 연속적으로 제거할 수 있다. PCTE 멤브레인과 PDMS 미세유체 구조 사이의 강력하고 돌이킬 수 없는 결합은 결합될 표면의 플라즈마 활성화에 이어 3-아미노프로필리에톡실란(APTES)의 용액으로 멤브레인을 코팅함으로써 달성된다. 컴퓨터 제어 시스템은 서로 다른 위치와 다른 강도의 사용자 정의 펄스 시퀀스를 생성하여 규정된 공간 및 시간적 가변성을 가진 리소스 풍경을 생성할 수 있습니다. 각 화학 적 풍경에서, 개별 규모에서 세균 운동의 역학 및 인구 수준에서의 축적을 얻을 수 있습니다.
서론
미생물은 화학 적 구배를 감지하고 반응1에서운동성을 수정하는 과정인 화학 요법에 의존하여 화학 적 경관을 탐색하고 영양공급원과 숙성에 접근하고 유해 물질을 탈출합니다. 이러한 마이크로 스케일 프로세스는 미생물과 환경 간의 상호 작용의 거시 적 역학을 결정2,3. 최근 연질 리소그래피4를포함한 미세 유체학 및 미세 제조 기술의 발전은 미생물의 상호 작용을 연구할 수 있는 제어된 미세 환경을 만드는 우리의 능력에 혁명을 일으켰습니다. 예를 들어, 과거 실험에서는 중급에서 고영양농도의 고도로 조절되고 안정된 그라데이션을 생성하여 세균화학을 연구한5,6. 그러나 자연 환경에서는 미세 크기의 화학 그라데이션이 단명할 수 있으며 분자 확산에 의해 소멸될 수 있으며 배경 조건은 종종 매우희석되어 7. 불안정한 화학 환경에 처음 노출된 미생물 집단의 화학반응을 직접 측정하기 위해 미세 유체 기술과 광분해를 결합하여 야생 박테리아가 자연에서 마주치는 그라데이션을 모방하는 방....
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프로토콜
1. 단일 화학 펄스 실험을위한 미세 유체 장치 제조
- CAD(컴퓨터 지원 설계) 소프트웨어를 사용하여 채널을 디자인하고 투명 필름에 인쇄하여 포토 마스크를만듭니다(그림 1A).
- 부드러운 리소그래피로 마스터를 제작합니다(클린룸 조건하에서).
- 실리콘 웨이퍼(4인치)를 아세톤, 메탄올 및 이소프로판올로 연속해서 세척한 다음 질소를 사용하여 건조시면 됩니다. 웨이퍼를 오븐에서 130°C에서 5분간 굽습니다.
- 웨이퍼를 스핀 코터 중앙에 놓고 SU-8 포토레지스트를 웨이퍼에 붓습니다. 스핀 코터의 속도를 5초 이상 500rpm까지 램프하고 10초 동안 500rpm으로 유지하며, 10초 이상의 최종 속도를 최대10초까지 램프하고 30초 동안 이 속도로 유지합니다.
참고: 최종 속도의 정확한 값은 대상 코팅 두께와 사용된 SU-8에 따라 달라집니다. - 스핀 코팅 공정 후, 웨이퍼를 65°C에서 구운 다음 95°C에서 굽습니다. 웨이퍼를 실온(RT)에서 5분 이상 식힙니다.
참고: 베이킹 시간은 사용된 포토레지스트의 두께와 유형에 따라 다릅니다. 일반적으로, 매 100 μm 층마다 웨이퍼는 65°C에서 5분, 95°C에서 45분....
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결과
우리는 동적 영양소 조건 하에서 세균 축적 프로파일을 연구하기 위해 미세 유체 및 밀리유체 장치(그림 1)를사용했습니다. 세균 궤적은 광용해에 의해 방출된 화학적 맥박에 따른 세균 집단의 축적-소산 역학의 상 대비 현미경 검사법에 의해 획득된 기록된 비디오에서 추출되었다(도2 및 그림 3). 수백만 개의 궤적을 평균화함으로써, 시선 의 드리프트 속도와 세균 농도의 시공간역학을 얻었다. 화학 그라데이션이 없는 상태에서 수영을 설명하는 통계는 더 높은 공간 및 시간적 분해능을 가진 별도의 실험에서 얻어졌다(그림4).
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토론
이 방법을 통해 연구원은 마이크로 및 밀리플루언스 장치에서 제어되고 동적 그라데이션하에서 세균 성 화학 요법을 연구하여 재현 가능한 데이터 수집을 가능하게합니다. 광분해에 의한 마이크로스케일에서 의한 화학펄스의 거의 즉각적인 생성은 박테리아가 다양한 소스로부터 야생에서 발생하는 영양소 펄스의 유형을 재현하는 것을 목표로 하며, 예를 들어, 가라앉는 해양입자(25)뒤에 있는 깃털의 확산, 또는 용해된 식물성 플랑크톤세포(26)로부터퍼지는 영양소를 재현하는 것을 목적으로 한다.
우리는이 방법의 두 가지 응용 프로그램을 제시: 1) 균일 한 조건에서 시작 하는 박테리아 축적-발산 역학을 연구 하는 단일 화학 펄스의 방출, 그리고 2) 비 평형 영양소 조건 하에서 박테리아 축적 프로필을 특성화 하는 다중 펄스의 릴리스. 첫번째 신청은 영양공급원을 처음 만날 때 미생물의 행동 반응을 특성화하기 위하여 특.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없다.
감사의 글
저자는 ETH 취리히에서 첫 번째 미세 가공 시설에 감사드립니다. 이 작품은 호주 연구위원회 발견 초기 경력 연구원 상 DE180100911 (D.R.B.), 고든과 베티 무어 해양 미생물 이니셔티브 조사자 상 GBMF3783 (R.S.에), 스위스 국립 과학 재단 보조금에 의해 지원되었다 1-002745-000 (R.S.로)
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| (3-Aminopropyl) triethoxysilane (APTES) | Sigma-Aldrich | A3648 | >98% 순도, 고독성 |
| CELLSTAR 튜브 | Greiner Bio-One | 210261 | 50 ml |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | - 박테리아 배양에서 사용한 배지 제거 |
| 디지털 인큐베이터 Incu-Line | VWR-CH | 390-0384 3D | 마스터 |
| 더스터 | 웨이퍼 및 마이크로 채널 청소를 위한 | VWR-CH | 16650-22 |
| 핫 플레이트 | VWR-CH | 444-0601 | 마이크로 채널 접착 |
| 소프로판올 | Sigma-Aldrich | W292907 | |
| LightSafe 마이크로 원심분리기 튜브 | Sigma-Aldrich | Z688312 | 1.5ml |
| MATLAB | Mathworks | 이미지 분석 및 박테리아 추적을 위한 | |
| 마이크로 원심분리기 튜브 | Eppendorf | 30120086 | 1.5 ml |
| 현미경 유리 슬라이드 | VWR-CH | 631-1552 | |
| 현미경 Nikon Eclipse TiE | Nikon Instruments | MEA53100 | with motorized stage |
| MNI-Glutamate | Tocris Bioscience | 1490 | >98 % 순도, 감광성 |
| 금형 프린팅 장비 | Stratasys | Objet30 3D 프린터 | |
| 금형 인쇄 서비스 | 3D 프린팅 스튜디오 | 사용자 정의 | https://www.3dprintingstudios.com/< / a |
| > Nanodrop One UV-Vis 분광 광도계 | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | 는 unaging |
| NIS 요소를 | Nikon Instruments | Microscope Imaging | |
| 오븐 Venti-Line | VWR-CH | 466-3516 | (강제 대류 포함) |
| 포토 레지스트 SU-8-3050 | MicroChem Corp. | SU8-3050 | |
| 플라즈마 챔버 Zepto | Diener Electronic | ZEPTO-1 | 를 접착하기 전에 표면을 기능화합니다 |
| . M 기공 크기, 19% 열린 공간, 24 & 마이크로; m 두께 | |||
| 폴리에틸렌 마이크로 튜빙 | 과학 상품 | BB31695-PE / 2 | ID x OD : 0.015 "x 0.043"/ 0.38mm x 1.09mm |
| 폴리스티렌 페트리 접시 | VWR-CH | 25373-100 | 바닥 표면 (90mm x 15mm)을 접착하여 millifluidic 장치 |
| 스케일 | VWR-CH | 611-2605 | PDMS 혼합물 |
| sCMOS 카메라 Andor Zyla | Oxford Instruments | 위상차 및 형광 현미경 (최대 100fps) | |
| 바다 소금 | 인스턴트 오션 | 제품 번호 SS1-160p | |
| SolidWorks 2015 | Dassault Systemes SolidWorks | 금형 Spectra | |
| X 조명 엔진 | Lumencolor | for LED 395 nm | |
| Sylgard 184 | Dow Corning | 110-41-155 | PDMS Si 엘라스토머 키트; 경화제 |
| 주사기 (Luer-Lok) | B Braun Omnifix | 4616308F | |
| 주사기 바늘 | Agani | A228 | 10에서 30 ml |
| 주사기 펌프 11 Pico Plus Elite | Harvard Apparatus | 70-4506 | Terumo Agani 23 게이지 5/8 인치 (16mm) |
| VeroGrey | Stratasys | 듀얼 주사기 펌프 | |
| Vortex-Genie | Scientific Industries | SI-0236 | 금형 재료 |
참고문헌
- Armitage, J. P., Lackie, J. M. The biology of the chemotactic response. , Cambridge University Press. (1991).
- Azam, F., Malfatti, F. Microbial structuring of marine ecosystems. Nature Reviews Microbiology. 5 (10), 782-791 (2007).
- Buchan, A., LeCleir, G. R., Gulvik, C. A., González, J. M.
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