Generazione di paesaggi chimici dinamici e controllati per studiare il comportamento microbico
Summary
Viene presentato un protocollo per la generazione di paesaggi chimici dinamici mediante fotolisi all’interno di configurazioni microfluidiche e millifluidiche. Questa metodologia è adatta per studiare diversi processi biologici, tra cui il comportamento motile, l’assorbimento di nutrienti o l’adattamento alle sostanze chimiche dei microrganismi, sia a livello di singola cellula che di popolazione.
Abstract
Dimostriamo un metodo per la generazione di impulsi chimici controllati e dinamici, dove il chemoattractant localizzato diventa improvvisamente disponibile su microscala, per creare micro-ambienti per esperimenti microbici chemiotassi. Per creare impulsi chimici, abbiamo sviluppato un sistema per introdurre le fonti di amminoacidi quasi istantaneamente mediante fotolisi di amminoacidi in gabbia all’interno di una camera microfluidica polidimetilsiloxana (PDMS) contenente una sospensione batterica. Abbiamo applicato questo metodo al batterio chemiotattico, Vibrio ordalii, che può scalare attivamente questi gradienti chimici dinamici mentre viene tracciato dalla microscopia video. Gli amminoacidi, resi biologicamente inerediti (‘ingabbiati’) dalla modifica chimica con un gruppo di protezione fotoriamo, sono uniformemente presenti nella sospensione ma non sono disponibili per il loro rilascio improvviso, che si verifica in punti di tempo e spazio definiti dall’utente mediante un fascio LED climatizzato vicino all’UV-A. Il numero di molecole rilasciate nell’impulso può essere determinato da una relazione di calibrazione tra il tempo di esposizione e la frazione disidratazione, dove lo spettro di assorbimento dopo la fotolisi è caratterizzato dall’utilizzo della spettroscopia UV-Vis. Una membrana in policarbonato nanoporoso (PCTE) può essere integrata nel dispositivo microfluidico per consentire la rimozione continua da parte dei composti non in gabbia e dei supporti esauriti. Un legame forte e irreversibile tra la membrana PCTE e la struttura microfluidica PDMS si ottiene rivestindo la membrana con una soluzione di 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) seguita dall’attivazione al plasma delle superfici da legare. Un sistema controllato dal computer può generare sequenze definite dall’utente di impulsi in luoghi diversi e con intensità diverse, in modo da creare paesaggi di risorse con prescritta variabilità spaziale e temporale. In ogni paesaggio chimico, è possibile ottenere la dinamica del movimento batterico su scala individuale e il loro accumulo a livello di popolazione, consentendo così la quantificazione delle prestazioni chemiotattiche e i suoi effetti sulle aggregazioni batteriche in ambienti ecologicamente rilevanti.
Introduction
I microbi si basano sulla chemiotassi, il processo di rilevamento dei gradienti chimici e di modifica della motilità in risposta1,per navigare nei paesaggi chimici, avvicinarsi a fonti di nutrienti e ospiti e sfuggire a sostanze nocive. Questi processi di microscala determinano la cinetica su macroscala delle interazioni tra i microbi e il loro ambiente2,3. I recenti progressi nella microfluidica e nelle tecnologie di microfabbricazione, tra cui la litografia morbida4,hanno rivoluzionato la nostra capacità di creare microambienti controllati in cui studiare le interazioni dei microbi. Ad esempio, esperimenti passati hanno studiato chemiotassi batterici generando gradienti altamente controllati e stabili di concentrazioni di nutrienti intermedi e ad alto5,6. Tuttavia, negli ambienti naturali, i gradienti chimici su microscala possono essere di breve durata, dissipati dalla diffusione molecolare, e le condizioni di fondo sono spesso altamente diluite7. Per misurare direttamente la risposta chemiotattica delle popolazioni microbiche prima esposte ad ambienti chimici instabili, abbiamo ideato e qui descritto metodi per combinare la tecnologia microfluidica con la fotolisi, imitando così i gradienti che i batteri selvatici incontrano in natura.
Uncaging technology impiega sonde sensibili alla luce che incapsulano funzionalmente le biomolecole in forma inattiva. L’irradiazione rilascia la molecola in gabbia, permettendo la perturbazione mirata di un processo biologico8. A causa del controllo rapido e preciso della chimica cellulare che lo sblocco offre9, fotolisi di composti in gabbia è stato tradizionalmente impiegato da biologi, fisiologi e neuroscienziati per studiare l’attivazione dei geni10, canali ionici11, e neuroni12. Più di recente, gli scienziati hanno sfruttato i vantaggi significativi della fotolisi per studiare la chemiotassi13, per determinare la dinamica di commutazione flagella di singole cellule batteriche esposte a uno stimolo chemioattraente passo14,15, e per studiare i modelli di motilità di singole cellule sperometrive in gradienti tridimensionali (3D)16.
Nel nostro approccio, implementiamo la fotolisi di aminoacidi in gabbia all’interno di dispositivi microfluidici per studiare la risposta comportamentale di una popolazione batterica agli impulsi chimici controllati, che diventano quasi istantaneamente disponibili attraverso il photorelease. L’uso di un obiettivo a basso ingrandimento (4x) (NA – 0,13, profondità di messa a fuoco di circa 40 m) consente sia l’osservazione della risposta aggregata a livello di popolazione di migliaia di batteri su un ampio campo visivo (3,2 mm x 3,2 mm), sia la misurazione del movimento a livello di singola cellula. Presentiamo due applicazioni di questo metodo: 1) il rilascio di un singolo impulso chimico per studiare la dinamica di accumulo batterico-dissipazione a partire da condizioni uniformi, e 2i) il rilascio di impulsi multipli per caratterizzare la dinamica di accumulo batterico in condizioni chemoaattrazionli eterogenee nel tempo. Questo metodo è stato testato sui batteri marini Vibrio ordalii che eseguono chemiotassi verso il glutammato aminoacido17, ma il metodo è ampiamente applicabile a diverse combinazioni di specie e chemioattraenti, nonché ai processi biologici oltre la chemiotassi (ad esempio, assorbimento di nutrienti, esposizione agli antibiotici, quorum sensing). Questo approccio promette di aiutare a chiarire l’ecologia e il comportamento dei microrganismi in ambienti realistici e di scoprire i compromessi nascosti che i singoli batteri affrontano durante la navigazione nei gradienti dinamici effimeri.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo metodo consente ai ricercatori di studiare la chemiotassi batterica sotto gradienti controllati e dinamici in dispositivi micro e millifluidi, consentendo l’acquisizione di dati riproducibili. La creazione quasi istantanea di impulsi chimici su microscala mediante fotolisi mira a riprodurre i tipi di legumi nutritivi che i batteri incontrano in natura da una serie di fonti, ad esempio la diffusione diffusa dei pennacchi dietro le particelle marine che affondano25, o il nutriente che si diff…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano la PRIMA struttura di microfabbricazione del PEE di zurighese. Questo lavoro è stato sostenuto da un Australian Research Council Discovery Early Career Researcher Award DE180100911 (a D.R.B.), un Gordon and Betty Moore Marine Microbial Initiative Investigator Award GBMF3783 (a R.S.), e una sovvenzione della Swiss National Science Foundation 1-002745-000 (a R.S.).
Materials
| (3-Aminopropyl) triethoxysilane (APTES) | Sigma-Aldrich | A3648 | >98% purity, highly toxic |
| CELLSTAR tube | Greiner Bio-One | 210261 | 50 ml |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | to eliminate spent media from the bacterial culture |
| Digital Incubators Incu-Line | VWR-CH | 390-0384 | to bake 3D master |
| Duster | VWR-CH | 16650-22 | to clean the wafer and microchannels |
| Hot plate | VWR-CH | 444-0601 | to bond the microchannels |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | W292907 | |
| LightSafe micro centrifuge tubes | Sigma-Aldrich | Z688312 | 1.5 ml |
| MATLAB | Mathworks | for image analysis and bacterial tracking | |
| Microcentrifuge tube | Eppendorf | 30120086 | 1.5 ml |
| Microscope glass slide | VWR-CH | 631-1552 | |
| Microscope Nikon Eclipse TiE | Nikon Instruments | MEA53100 | with motorized stage |
| MNI-Glutamate | Tocris Bioscience | 1490 | >98 % purity, photosensitive |
| Mold printing equipment | Stratasys | Objet30 3D printer | |
| Mold printing service | 3D Printing Studios | Custom | https://www.3dprintingstudios.com/ |
| Nanodrop One UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | to calibrate the uncaging |
| NIS Elements | Nikon Instruments | Microscope Imaging Software | |
| Oven Venti-Line | VWR-CH | 466-3516 | to bake PDMS (with forced convection) |
| Photoresist SU-8-3050 | MicroChem Corp. | SU8-3050 | |
| Plasma chamber Zepto | Diener Electronic | ZEPTO-1 | to functionalize the surfaces before bonding |
| Polycarbonate membrane | Sterlitech | PCT0447100 | 0.4 µm pore size, 19 % open area, 24 µm thickness |
| Polyethylene microtubing | Scientific Commodities | BB31695-PE/2 | I.D. x O.D.: 0.015" x 0.043" / 0.38mm x 1.09mm |
| Polystyrene Petri dish | VWR-CH | 25373-100 | bottom surface (90 mm x 15 mm) to bond the millifluidic device |
| Scale | VWR-CH | 611-2605 | to weight PDMS mixture |
| sCMOS camera Andor Zyla | Oxford Instruments | for phase contrast and fluorescence microscopy (max 100 fps) | |
| Sea salt | Instant Ocean | Product No. SS1-160p | |
| SolidWorks 2015 | Dassault Systemes SolidWorks | Used to design the mold | |
| Spectra X light engine | Lumencolor | for LED 395 nm | |
| Sylgard 184 | Dow Corning | 110-41-155 | PDMS Si Elastomer Kit; curing agent |
| Syringe (Luer-Lok) | B Braun Omnifix | 4616308F | |
| Syringe Needle | Agani | A228 | from 10 to 30 ml |
| Syringe Pump 11 Pico Plus Elite | Harvard Apparatus | 70-4506 | Terumo Agani 23 gauge 5/8 inch (16mm) |
| VeroGrey | Stratasys | Dual Syringe Pump | |
| Vortex-Genie | Scientific Industries | SI-0236 | Mold Material |
References
- Armitage, J. P., Lackie, J. M. . The biology of the chemotactic response. , (1991).
- Azam, F., Malfatti, F. Microbial structuring of marine ecosystems. Nature Reviews Microbiology. 5 (10), 782-791 (2007).
- Buchan, A., LeCleir, G. R., Gulvik, C. A., González, J. M. Master recyclers: features and functions of bacteria associated with phytoplankton blooms. Nature Reviews Microbiology. 12 (10), 686-698 (2014).
- Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft lithography in biology and biochemistry. Annual Review of Biomedical Engineering. 3, 335-373 (2001).
- Segall, J. E., Block, S. M., Berg, H. C. Temporal comparisons in bacterial chemotaxis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (23), 8987-8991 (1986).
- Waite, A. J. Non-genetic diversity modulates population performance. Molecular Systems Biology. 12 (12), 895 (2016).
- Stocker, R. Marine Microbes See a sea of gradients. Science. 338 (6107), 628-633 (2012).
- Ellis-Davies, G. C. R. Caged compounds: photorelease technology for control of cellular chemistry and physiology. Nature Methods. 4 (8), 619-628 (2007).
- Kaplan, J. H., Somlyo, A. P. Flash photolysis of caged compounds: New tools for cellular physiology. Trends in Neurosciences. 12 (2), 54-59 (1989).
- Ando, H., Furuta, T., Tsien, R. Y., Okamoto, H. Photo-mediated gene activation using caged RNA/DNA in zebrafish embryos. Nature Genetics. 28 (4), 317-325 (2001).
- England, P. M., Lester, H. A., Davidson, N., Dougherty, D. A. Site-specific, photochemical proteolysis applied to ion channels in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (20), 11025-11030 (1997).
- Fino, E. RuBi-Glutamate: Two-photon and visible-light photoactivation of neurons and dendritic spines. Frontiers in Neural Circuits. 3, (2009).
- Khan, S., Spudich, J. L., McCray, J. A., Trentham, D. R. Chemotactic signal integration in bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (21), 9757-9761 (1995).
- Sagawa, T. Single-Cell E. coli Response to an Instantaneously Applied Chemotactic Signal. Biophysical Journal. 107 (3), 730-739 (2014).
- Xie, L., Lu, C., Wu, X. L. Marine Bacterial Chemoresponse to a Stepwise Chemoattractant Stimulus. Biophysical Journal. 108 (3), 766-774 (2015).
- Jikeli, J. F., et al. Sperm navigation along helical paths in 3D chemoattractant landscapes. Nature Communications. 6, 7985 (2015).
- Brumley, D. R., et al. Bacteria push the limits of chemotactic precision to navigate dynamic chemical gradients. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (22), 10792-10797 (2019).
- Aran, K., Sasso, L. A., Kamdar, N., Zahn, J. D. Irreversible, direct bonding of nanoporous polymer membranes to PDMS or glass microdevices. Lab on a Chip. 10 (5), 548 (2010).
- ZoBell, C. E. The cultural requirements of heterotrophic aerobes. Journal of Marine Research. 4, 42-75 (1941).
- Canepari, M., Nelson, L., Papageorgiou, G., Corrie, J. E. T., Ogden, D. Photochemical and pharmacological evaluation of 7-nitroindolinyl-and 4-methoxy-7-nitroindolinyl-amino acids as novel, fast caged neurotransmitters. Journal of Neuroscience Methods. 112 (1), 29-42 (2001).
- Trigo, F. F., Corrie, J. E. T., Ogden, D. Laser photolysis of caged compounds at 405nm: Photochemical advantages, localisation, phototoxicity and methods for calibration. Journal of Neuroscience Methods. 180 (1), 9-21 (2009).
- Ribeiro, A. C. F. Mutual diffusion coefficients of L-glutamic acid and monosodium L-glutamate in aqueous solutions at T=298.15K. The Journal of Chemical Thermodynamics. 74, 133-137 (2014).
- Sharqawy, M. H., Lienhard, J. H., Zubair, S. M. Thermophysical properties of seawater: a review of existing correlations and data. Desalination and Water Treatment. 16 (1-3), 354-380 (2010).
- . Nikon depth of field calculator Available from: https://www.microscopyu.com/tutorials/depthoffield (2019)
- Kiørboe, T., Thygesen, U. H. Fluid motion and solute distribution around sinking aggregates: II. Implications for remote detection by colonizing zooplankters. Marine Ecology Progress Series. 211, 15-25 (2001).
- Blackburn, N., Fenchel, T., Mitchell, J. Microscale nutrient patches in planktonic habitats shown by chemotactic bacteria. Science. 282 (5397), 2254-2256 (1998).
- Stocker, R., Seymour, J. R., Samadani, A., Hunt, D. E., Polz, M. F. Rapid chemotactic response enables marine bacteria to exploit ephemeral microscale nutrient patches. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (11), 4209-4214 (2008).
- Altindal, T., Chattopadhyay, S., Wu, X. L. Bacterial chemotaxis in an optical trap. PLoS ONE. 6 (4), 18231 (2011).
- Zhu, X., et al. Frequency-Dependent Escherichia coli Chemotaxis behavior. Physical Review Letters. 108 (12), (2012).
- Baraban, L., Harazim, S. M., Sanchez, S., Schmidt, O. G. Chemotactic behavior of catalytic motors in microfluidic channels. Angewandte Chemie International Edition. 52 (21), 5552-5556 (2013).
