초파리 유충에 있는 Oenocytes의 해부 그리고 지질 물방울 염색

Summary

여기에 제시된 보디피 493/503, 지질 방울 특이적 형광 염료를 사용하여 드로소필라 유충에서 에노세포의 해종 및 지질 방울 염색에 대한 상세한 방법이 제시되어 있다.

Abstract

지질은 동물 발달과 생리적 항상성에 필수적입니다. 지질 대사의 dysregulation는 각종 발달 결함 및 질병, 비만 및 지방 간 과 같은 귀착됩니다. 일반적으로 지질은 세포의 다기능 지질 저장 소기관인 지질 방울에 저장됩니다. 지질 방울 크기와 다른 조직에서 다른 조건에서 수 다양. 지질 방울은 그것의 생발생 및 저하의 규제를 통해 단단히 통제 되는 보고 되었습니다. Drosophila melanogaster에서,oenocyte는 지질 물질 대사를 위한 중요한 조직이고 최근 스트레스에 응하여 지질 동원에 관하여 인간 간 유사체로 확인되었습니다. 그러나, oenocytes에 있는 지질 물방울 물질 대사의 규칙의 밑에 기계장치는 애매하게 남아 있습니다. 이 문제를 해결하기 위해, 개발 중 및 스트레스 조건 하에서 지질 방울 동적 변화를 직접 시각화하는 신뢰할 수 있고 민감한 방법을 개발하는 것이 가장 중요합니다. 여기에 설명된 지질 방울 특이적 형광 염료인 친유성 BODIPY 493/503을 활용하면 기아에 대한 반응으로 드로소필라 유충의 선혈구에서 해부 및 후속 지질 방울 염색에 대한 상세한 프로토콜이 설명되어 있다. 이것은 공초점 현미경 검사법에 의하여 각종 조건 의 밑에 지질 작은 물방울 역학의 질적인 분석을 허용합니다. 또한, 이 신속 하 고 높은 재현 가능한 방법은 또한 oenocytes 및 다른 조직에 지질 방울 대사를 포함 하는 새로운 유전 요인을 식별 하기 위한 유전 화면에서 사용할 수 있습니다.

Introduction

지질은 세포 생존에 필수적입니다. 세포막 시스템의 필수 구성 요소로서의 전통적인 역할 외에도 지질은 또한 개별 동물의 수명 주기 전반에 걸쳐 에너지 공급 및 신호 변환에 중요한 기능을 합니다^1. 따라서 지질 대사는 세포에서 생리적 지혈을 유지하기 위해 엄격한 규정을 준수해야합니다. 지질 대사의 조절은 당뇨병이나 지방간 과 같은 다양한 질병을 초래하는 것으로 알려져 있다. 동물 건강에 지질 대사의 큰 중요성에도 불구 하 고, 지질 물질 대사 규칙 기본 메커니즘 크게 알 수 없는 남아.

초파리는 토마스 H. 모건 교수가 유전학 및 기타 기본적인 생물학적 질문을 포함하는 연구에서 그들을 사용하기 시작한 이후 년 동안 광범위하게 사용되어왔다². 지난 수십 년 동안, 새로운 증거는 Drosophila가 비만^1,3과같은 많은 지질 물질 대사 관련 질병의 연구에서 우수한 모델 유기체임을 보여주었습니다. 특히, Drosophila는 인간과 고도로 보존된 신진 대사 유전자를 공유하고 지질 물질 대사를 위한 유사한 관련 조직....

Protocol

1. 계란 누워

1. 계란 누워 표준 옥수수 가루 음식을 준비합니다.
   참고: 여기에서 사용되는 표준 옥수수 가루 식품에 대한 조리법 및 조리 절차는 이전에 게시 된 세부^{사항 15를}참조하십시오.
2. 50 mL 원심 튜브에 활성 건조 효모 4g에 증류수 6 mL을 추가하여 신선한 효모 페이스트를 준비합니다. 주걱을 사용하여 섞어서 페이스트를 만듭니다.
3. 옥수수 가루 음식을 병에 채우고 약 1 g의 효모 페이스트를 주걱으로 옥수수 가루 음식의 표면에 펴서 계란 누워 병을 만듭니다.
4. 원하는 유전자형의 파리를 계란 누워 병에 놓고 25 ° C의 일정한 온도와 60 %의 습도로 인큐베이터에 놓습니다.
   참고: 이상적인 십자가는 일반적으로 150 처녀 파리와 적어도 75 남성으로 구성되어 있습니다. 계란 누워 병 위에 방대한 상자를 배치하여 어두운 파리를 유지하는 것은 재생 속도를 증가시킬 것이다.
5. 계란 수집 하기 전에, 파리 여성 난관에 저장 남아 있는 모든 오래 된 계란의 제거를 허용 하기 위해 1 시간 동안 계란을 낳을 수 있습니다.
6. 파리가 1 시간 동안 새로운 계란 누워 병에 계란을 낳고 병....

Results

이 절차의 성공적인 실행은 oenocytes에 있는 지질 작은 물방울의 수 그리고 크기를 드러내는 명확한 지질 작은 물방울 얼룩 귀착될 것입니다. 그림 1A,A',A''는 다른 발달 단계 동안 정상적인 먹이 유충의 oenocytes에 검출 가능한 지질 방울 (녹색 점)이 거의 없다는 것을 보여줍니다. 도 1B, B', B'는 12h(B), 24h(B'), 및 36시간(B') 기아 기간에 반응하여 에노세포에서 지질 방울(녹색 점)의 양을 증가시다. 96 시간 후, 먹이 애벌레 (A) oenocytes에 일부 지질 방울 축적을 표시 하는 것 같았다 주목 해야 한다, 그들의 빠른 성장 속도 때문일 수 있습니다. 연구원은이 단계 도중 애벌레를 취급할 때 증가한 주의를 지불해야 합니다.

Discussion

위에서 설명한 것 중에는 이 프로토콜에 몇 가지 중요한 단계가 있으며, 계란 누워 기간은 이들 중 하나입니다. 지질 동원 조직으로서, 에노세포는 영양 상태에 매우 민감하다^6,8. 장기간 계란 누워 기간 까마귀 애벌레 와 증가 식품 경쟁 귀 착될 수 있습니다., 부정확 한 결과 선도. 이 프로토콜에 사용되는 1 시간 계란 누워 기간은 유충이 영양 경쟁없이 개발할 수 있습니다. 더 긴 계란 누워 기간에서 유래할 수 있는 애벌레의 훨씬 더 큰 수는 또한 지질 물방울 양 및 패턴 (예를 들면, 크기, 수 및 형태학)에 eenocytes에 영향을 미칠 수 있습니다.

추가적으로, 연장된 계란 누워 기간은 또한 발달 단계의 넓은 변이를 가진 애벌레 인구에서 유래합니다. 이 맥락에서, 연구원은 배아 또는 애벌레 발달에 영향을 미치는 돌연변이를 사용할 때 주의해야 한다, 지질 방울 패턴에 미.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 mL 원심분리기 튜브	Corning	430829	50 mL
6 cm 페트리 접시	Thermo Fisher	150326	6 cm
한천			플라이 식품용
알루미늄 호일	해당 사항 없음	없음	으로부터 메이플 보호
BODIPY 493/503	Invitrogen	D3922	지질 방울 염색 염료
컨포칼 현미경	라이카	Leica TSC SP5	컨포칼 이미징
옥수수 시럽			플라이 푸드
옥수수 가루			플라이 푸드 Coverslip
	Citoglas	10212424C	20 × 20 mm, 0.13-0.17 두께
해부 핀	N/A	N/A
해부 플레이트	N/A	N/A
여과지	N/A	N / A	직경 : 11cm
고정 버퍼	N /	A	4 % 파라 포름 알데히드 (PFA) 1x PBS
집게	Dumont	11252-30	# 5
인큐베이터	Jiangnan	SPX-380	플라이 문화
마이크로 원심 분리기 튜브	용 Axygen	MCT-150-C	1.5 mL
현미경 슬라이드	Citoglas	10127105P-G
마운팅 매체	VECTASHIELDAntifade 마운팅 매체	H-1000	안티페이드 마운팅 매체
매니큐어	PanEra	AAPR419	커버 슬립
페인트브러시	해당	없음 해당 없음
PBS	해당 없음	없음	1x PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4,1.8 mM KH2PO4, pH 7.4)
로테이터	Kylin-Bell Lab Instruments	WH-986
가위	Smartdata Medical	SR81	Vannas 봄 가위
콩 가루			플라이 식품
주걱	N / A	N / A
표준 옥수수 가루	N / A	/ A	블루밍턴 표준 옥수수 가루 식품 레시피에 따라
코딩 스테레오 현미경	Leica	Leica S6E	조직 해부용
와이프 페이	N/A	N/A
효모			플라이 푸드용
yw	실험실 재고로 보관	N/A	초파리