Användning av mikroskala termofores för att mäta protein-lipidinteraktioner

Summary

Mikroskala termofores erhåller bindande konstanter snabbt till låg materialkostnad. Antingen märkt eller etikettfri termofores i mikroskala är kommersiellt tillgänglig; Etikettfri termofores kan dock inte mångfald av interaktionsmätningar som kan utföras med fluorescerande etiketter. Vi tillhandahåller ett protokoll för märkta termoforesmätningar.

Abstract

Förmågan att bestämma lipidernas bindningstillhörighet till proteiner är en viktig del av förståelsen av protein-lipidinteraktioner i membranhandel, signaltransduktion och cytoskeletal ombyggnad. Klassiska verktyg för att mäta sådana interaktioner inkluderar ytplasmonresonans (SPR) och isoterm titreringskalkorimetri (ITC). Även om de är kraftfulla verktyg har dessa tillvägagångssätt bakslag. ITC kräver stora mängder renat protein samt lipider, vilket kan vara kostsamt och svårt att producera. Dessutom är ITC och SPR mycket tidskrävande, vilket kan öka kostnaden för att utföra dessa experiment avsevärt. Ett sätt att kringgå dessa begränsningar är att använda den relativt nya tekniken för mikroskala termofores (MST). MST är snabbt och kostnadseffektivt med små mängder prov för att erhålla en mättnadskurva för en given bindningshändelse. Det finns för närvarande två typer av MST-system tillgängliga. En typ av MST kräver märkning med fluorofor i det blå eller röda spektrumet. Det andra systemet förlitar sig på den inneboende fluorescensen hos aromatiska aminosyror i UV-området. Båda systemen detekterar molekylers rörelse som svar på lokaliserad induktion av värme från en infraröd laser. Varje tillvägagångssätt har sina fördelar och nackdelar. Etikettfri MST kan använda otaggade inhemska proteiner; emellertid, många analyter, inklusive läkemedel, fluoresce i UV-området, vilket kan störa bestämning av exakta KD värden. I jämförelse möjliggör märkt MST en större mångfald av mätbara parvis interaktioner med fluorescerande märkta sonder fästa vid ligands med mätbara absorbanser i det synliga intervallet i motsats till UV, vilket begränsar risken för störande signaler från analyter.

Introduction

Mikroskala termofores är en relativt ny teknik för att bestämma disassociation konstanter (KD) samt hämningskonstanter (_IC50) mellan biokemiskt relevanta ligands. Den ledande kommersiella återförsäljaren för MST (t.ex. NanoTemper) erbjuder två populära MST-tekniker: 1) Etikettfri MST som kräver en fluorescerande tagg och 2) märkt termofores med hjälp av den inneboende fluorescensen av proteiner beroende på antalet aromatiska rester som finns i varje ^protein1. En nackdel med etikettfri termofores är att det i de flesta fall inte tillåter mätning av protein-proteininteraktioner. Det kan dock vara möjligt att konstruera proteiner utan aromatiska aminosyror såsom tryptofan för användning i etikettfri termofores2.

MST mäter partiklarnas rörelse som svar på induktion av mikroskopiska temperaturfält som initierats av en infraröd laser i den teknik som för närvarande finns ^{tillgänglig1}. MST kan användas för att mäta protein-proteininteraktioner, protein-lipidinteraktioner, protein-liten molekyl, tävlingsexperiment och till och med interaktioner mellan småmolekyler så länge man kan producera tillräckligt med signalseparation. Dessutom möjliggör MST mätning av membran-proteinbaserade interaktioner inbäddade i antingen liposomer eller nanodiscs. Märkt termofores utnyttjar användningen av fluorescerande märkta taggar som möjliggör kemiskt kontrollerbar separation av signal mellan ligand och analyt. KD-värden kan erhållas med termofores för interaktioner som involverar proteinbindning vid låga nanomolära koncentrationer, vilket i de flesta fall är en mycket lägre koncentration av protein än vad som krävs för isotermisk kalorimetri (ITC)³. Mst har inte heller strikta buffringskrav som krävs för ytplasmonresonans (SPR)⁴ och märkt termofores kan till och med användas för att mäta bindningskonstanter av proteiner av intresse från icke-helt renade ^{proteinlösningar5} med genetiskt insatta fluorescerande ^taggar6. En nackdel med MST är att kinetiska parametrar inte lätt kan erhållas för MST som i ^SPR2.

Termoforesmätningar beror på den lokala temperaturskillnaden för en lösning. Denna värme kan genereras från en infraröd laser. MST-enheten har en fluorescensdetektor kopplad till en infraröd (IR) stråle och kan fånga upp förändringar i fluorescens från lokala koncentrationsförändringar av fluorescerande molekyler vid den punkt där IR-lasern är riktad. MST-enheten använder en IR-riktad laser kopplad direkt till en fluorescensdetektor fokuserad vid samma punkt där värmen genereras i lösningen. Detta möjliggör robust detektion av temperaturförändringar som motsvarar utarmningen av molekyler vid värmepunkten som genereras av IR-lasern. Uppmätt fluorescens minskar i allmänhet närmare IR-lasern som svar på temperaturökningar. De skillnader som mäts som ett resultat kan bero på flera faktorer inklusive laddning, storlek eller solvation entropi. Dessa skillnader mäts som förändringar i fluorescens som svar på induktion av värme eller rörelse av molekyler från varma till kallare delar av kapillären.

Vid lastning av en kapillär med en given lösning är det viktigt att lämna luft i vardera änden av kapillären och inte ladda kapillären helt full. Den kommersiella kapillären rymmer ca 10 μL lösning. Man kan uppnå exakta mätningar med 5 μL lösning så länge lösningen manipuleras till mitten av kapillären, det finns inga luftbubblor (potentiellt avgas innan man laddar kapillär), och man är noga med att ladda racket för att inte jostle lösningen från mitten av kapillären, där den infraröda lasern är riktad. Om lasern inte kommer i full kontakt med lösningen kommer resultatet sannolikt att bli en av tre oanvändbara utgångar för den koncentrationen: 1) ingen eller låg fluorescensdetektering, 2) högre fluorescensdetektering (eventuellt med ojämn topp) eller 3) fluorescensdetektering inom andra värden från given titrering, men med en ojämn och oavslutad topp.

För märkt termofores är det optimalt att ha en fluorescenssignal över 200 och under 2000 fluorescensenheter7. MST-enheten använder en rad LED-intensiteter från 0 till 100, som kan väljas för att uppnå en signal över 200 eller under 2000. Alternativt kan man använda olika koncentrationer av den märkta liganden för att modifiera fluorescenssignalen till en optimal nivå. Det är viktigt att köra en cap-skanning med en viss MST-mätning som referens när du analyserar data, eftersom en dålig cap-skanning ofta kan resultera i en punkt som senare kan bestämmas vara en avvikande. Varje körning bör ta cirka 30 min om du mäter en enda MST-effekt med en cap-skanning. De kommersiella enheterna tillåter ändringar i MST-ström. I äldre programvaruversioner kan detta ställas in från 0 till 100; och i senare versioner kan man välja låg, medelhög eller hög MST. För att uppnå robusta spår kan en forskare behöva prova var och en av dessa och bestämma vilken MST-inställning som resulterar i de mest robusta data för en viss interaktion.

Protocol

1. Beredning av material Förbered fosfatbuffrad saltlösning (PBS): 137 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM NaH2PO4 och 2 mM KH2PO4, pH 7,41. Förbered NTA-Atto 647 N färgämne. Späd beståndet NTA-Atto 647 N färgämne till 100 nM från en 100% DMSO-lösning till PBS utan interpolering. Express Vam7-His8 – Protein som fusionsprotein i E. coli och rena med Ni-NTA och storleksuteslutningskromatografi8.<…

Representative Results

Det här är ett exempelutdata som använder tillhörighetsanalysen. Den märkta MST användes för att bestämma bindkonstanten av Vam7-His8 till den lösliga dioctanoyl (DiC8) PA för ett av dess naturliga substrat9. Figur 1 presenterar de termofetiska spåren från en studie av en 1:1 titrering av DiC8 PA från 500 μM mot 50 nM Vam7-His8. Initial fluorescens (tid innan infraröd laser slogs på), Tjump (tid initialt efter infraröd laser påslagen) och termofores …

Discussion

Bestämningen av Vam7-His8binding till DiC8-PA gav en robust monterad KD för den givna interaktionen, vilket är något lägre affinitet än den uppmätta KD av Vam7-His8 till PA liposomer (opublicerade). Denna skillnad beror sannolikt på bristen på ett membran, vilket i allmänhet resulterar i lägre affinitet för membranspecifika lipidbindningsinteraktioner och visar därför rollen för liposommembranställningen till denna ^{interaktion11</…}

Materials

Cy5 Maleimide Mono-Reactive Dye	GE Healthcare	PA23031	For protein labeleing
Graphpad Prsim	Graphpad software
Monolith NT.115 Capillaries (1000 count)	Nanotemper	MO-K022	Capillaries for MST
Monolith NT.115 machine	Nanotemper		University equipment
NTA-Atto 647 N	Sigma	2175	label for His tags
Phosphatidylinositol 3-phosphate diC8 (PI(3)P diC8)	Echelon	P-3008	Lipid for binding experiments