Teste de hemocompatibilidade de implantes de contato com o sangue em um modelo de loop de fluxo imitando o fluxo sanguíneo humano
Summary
Este protocolo descreve uma avaliação abrangente da hemocompatibilidade de dispositivos de contato com o sangue usando implantes neurovasculares cortados a laser. Um modelo de loop de fluxo com sangue humano fresco e heparinizado é aplicado para imitar o fluxo sanguíneo. Após a perfusão, vários marcadores hematológicos são analisados e comparados aos valores obtidos diretamente após a coleta de sangue para avaliação da hemocompatibilidade dos dispositivos testados.
Abstract
O uso crescente de dispositivos médicos (por exemplo, enxertos vasculares, stents e cateteres cardíacos) para fins temporários ou permanentes que permanecem no sistema circulatório do corpo exige uma abordagem confiável e multiparamétrica que avalia as possíveis complicações hematológicas causadas por esses dispositivos (ou seja, ativação e destruição de componentes sanguíneos). O teste abrangente de hemocompatibilidade in vitro de implantes de contato com o sangue é o primeiro passo para a implementação bem-sucedida in vivo. Portanto, a análise extensiva de acordo com a Organização Internacional para a Padronização 10993-4 (ISO 10993-4) é obrigatória antes da aplicação clínica. O ciclo de fluxo apresentado descreve um modelo sensível para analisar o desempenho hemostático dos stents (neste caso, neurovascular) e revelar efeitos adversos. O uso de sangue inteiro humano fresco e amostragem de sangue suave são essenciais para evitar a pré-ativação do sangue. O sangue é perfundido através de uma tubulação heparinizada contendo a amostra de ensaio usando uma bomba peristáltica a uma taxa de 150 mL/min a 37 °C por 60 min. Antes e depois da perfusão, marcadores hematológicos (i.e., contagem de células sanguíneas, hemoglobina, hematócrito e marcadores plasmáticos) indicando a ativação de leucócitos (polimorfonuclear [PMN]-elastase), plaquetas (β-tromboglobulina [β-TG]), o sistema de coagulação (thombin-antitrombina III [TAT]), e a cascata complementar (SC5b-9) são analisadas. Em conclusão, apresentamos um modelo essencial e confiável para testes extensivos de hemocompatibilidade de stents e outros dispositivos de contato com o sangue antes da aplicação clínica.
Introduction
A aplicação in vivo de implantes e biomateriais, que interagem com o sangue humano, requer intensos testes pré-clínicos com foco na investigação de vários marcadores do sistema hemosático. A Organização Internacional para a Padronização 10993-4 (ISO 10993-4) especifica os princípios centrais para a avaliação de dispositivos de contato com o sangue (ou seja, stents e enxertos vasculares) e considera o projeto do dispositivo, utilidade clínica e materiais necessários1.
O sangue humano é um fluido que contém várias proteínas e células plasmáticas, incluindo leucócitos (glóbulos brancos [CS),eritrócitos (glóbulos vermelhos [RBCs]) e plaquetas, que realizam funções complexas no corpo humano2. O contato direto de materiais estranhos com sangue pode causar efeitos adversos, como a ativação do sistema imunológico ou coagulante, que pode levar a inflamações ou complicações trombóticas e problemas graves após a implantação3,4,5. Portanto, a validação da hemocompatibilidade in vitro oferece uma oportunidade anterior à implantação para detectar e excluir quaisquer complicações hematológicas que possam ser induzidas ao contato do sangue com uma superfície estranha6.
O modelo de loop de fluxo apresentado foi estabelecido para avaliar a hemocompatibilidade de stents neurovasculares e dispositivos similares, aplicando uma taxa de fluxo de 150 mL/min na tubulação (diâmetro de 3,2 mm) para imitar condições de fluxo cerebral e diâmetros da artéria2,7. Além da necessidade de um modelo in vitro ideal, a fonte de sangue é um fator importante na obtenção de resultados confiáveis e inalterados ao analisar a hemocompatibilidade de um biomaterial8. O sangue coletado deve ser usado imediatamente após a amostragem para evitar alterações causadas pelo armazenamento prolongado. Em geral, uma coleta suave de sangue sem estase usando uma agulha de 21 G deve ser realizada para minimizar a pré-ativação de plaquetas e a cascata de coagulação durante a coleta de sangue. Além disso, os critérios de exclusão dos doadores incluem aqueles que fumam, estão grávidas, estão em estado de saúde ruim ou tomaram contraceptivos orais ou analgésicos nos últimos 14 dias.
Este estudo descreve um modelo in vitro para o extenso teste de hemocompatibilidade de implantes de stent em condições de fluxo. Ao comparar os stents revestidos com fibrina-heparina, os resultados dos testes abrangentes de hemocompatibilidade refletem a hemocompatibilidade melhorada dos stents revestidos com fibrina-heparina9. Em contraste, os stents não revestidos induzem a ativação da cascata de coagulação, como demonstrado por um aumento nas concentrações de thombin-antitrombina III (TAT) e perda de números de plaquetas sanguíneas devido à adesão das plaquetas à superfície do stent. No geral, recomenda-se a integração deste modelo de hemocompatibilidade como teste pré-clínico para detectar quaisquer efeitos adversos no sistema hemosático causados pelo dispositivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo apresentado descreve um método abrangente e confiável para o teste de hemocompatibilidade de implantes de contato com o sangue de acordo com a ISO 10993-4 em um modelo de fluxo de cisalhamento imitando o fluxo sanguíneo humano. Este estudo baseia-se no teste de implantes neurovasculares cortados a laser, mas pode ser realizado com uma variedade de amostras. Os resultados demonstram que este método permite a análise ampla de vários parâmetros, como a contagem de células sanguíneas, prevalência de vá…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Pela realização da microscopia eletrônica de varredura, agradecemos a Ernst Schweizer da seção de Ciência e Tecnologia de Materiais Médicos do Hospital Universitário tuebingen. A pesquisa contou com o apoio do Ministério da Educação, Juventude e Esportes do CR dentro do Programa Nacional de Sustentabilidade II (Projeto BIOCEV-FAR LQ1604) e pelo projeto da Fundação Ciência Tcheca nº 18-01163S.
Materials
| aqua ad iniectabilia | Fresenius-Kabi, Bad-Homburg, Germany | 1088813 | |
| beta-TG ELISA | Diagnostica Stago, Duesseldorf, Germany | 00950 | |
| Centrifuge Rotana 460 R | Andreas Hettich, Tuttlingen, Germany | – | |
| Citrat monovettes (1.4 mL) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 6,16,68,001 | |
| CTAD monovettes (2.7 mL) | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 367562 | |
| EDTA monovettes (1.2 mL) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 6,16,62,001 | |
| Ethanol p.A. (1000 mL) | AppliChem, Darmstadt, Germany | 1,31,08,61,611 | |
| Glutaraldehyde (25 % in water) | SERVA Electrophoresis, Heidelberg, Germany | 23114.01 | |
| Heparin coating for tubes | Ension, Pittsburgh, USA | – | |
| Heparin-Natrium (25.000 IE/ 5 mL) | LEO Pharma, Neu-Isenburg, Germany | PZN 15261203 | |
| Multiplate Reader Mithras LB 940 | Berthold, Bad Wildbad, Germany | – | |
| NaCl 0,9% | Fresenius-Kabi, Bad-Homburg, Germany | 1312813 | |
| Neutral monovettes (9 mL) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 2,10,63,001 | |
| PBS buffer (w/o Ca2+/Mg2+) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 70011044 | |
| Peristaltic pump ISM444B | Cole Parmer, Wertheim, Germany | 3475 | |
| Pipette (100 µL) | Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany | 3124000075 | |
| Pipette (1000 µL) | Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany | 3123000063 | |
| Plastic container (100 mL) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 7,55,62,300 | |
| PMN-Elastase ELISA | Demeditec Diagnostics, Kiel Germany | DEH3311 | |
| Polyvinyl chloride tube | Saint-Gobain Performance Plastics Inc., Courbevoie France | – | |
| Reaction Tubes (1.5 mL) | Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany | 30123328 | |
| neurovascular laser-cut implants | Acandis GmbH, Pforzheim | 01-0011x | |
| SC5b-9 ELISA | TECOmedical, Buende, Germany | A029 | |
| Scanning electron microscope | Cambridge Instruments, Cambridge, UK | – | |
| Sealing tape (96 well plate) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 15036 | |
| Syringe 10/12 mL Norm-Ject | Henke-Sass-Wolf, Tuttlingen, Germany | 10080010 | |
| TAT micro kit | Siemens Healthcare, Marburg, Germany | OWMG15 | |
| Waterbath Type 1083 | Gesellschaft für Labortechnik, Burgwedel, Germany | – |
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