Summary

Tek Hücretranskripsiyonel Profillerini Analiz Etmek Için Lazer Yakalama Mikrodisseksive Mikroakışkan QPCR'nin Birleştirilmesi: Opioid Bağımlılığına Sistem Biyolojisi Yaklaşımı

Published: March 08, 2020
doi:

Summary

Bu protokol, lazer yakalama mikrodisseksi kullanarak yüksek doğruluk ve anatomik özgüllük ile amigdala merkezi çekirdeğinden tek nöron, mikroglia ve astrosit toplamak için nasıl açıklar. Ayrıca, bu hücrelerin transkripsiyonu bir alt kümesini ölçmek için mikroakışkan RT-qPCR kullanımımızı açıklarız.

Abstract

Anatomik olarak komşu tek hücrelerde derin transkripsiyonel heterojenlik, hücresel fenotip çeşitliliği ile sağlam doku işlevselliğinin sağlanabileceğini düşündürmektedir. Biyolojik sistemlerin ağ dinamiklerini araştıran tek hücreli deneyler, biyolojik olarak anlamlı çözünürlükte çeşitli koşullara hücresel ve doku tepkilerini göstermektedir. Burada, anatomik olarak belirli yerlerden tek hücre toplama ve gen ekspresyonu profillerinin bir alt kümesini doğru bir şekilde ölçme yöntemlerimizi açıklıyoruz. Lazer yakalama mikrodizsikimi (LCM) ile mikroakışkan ters transkripsiyon kantitatif polimeraz zincir reaksiyonlarını (RT-qPCR) birleştiriyoruz. Ayrıca bağırsak içeriğinin mikrobiyal bolluğunu ölçmek için bu mikroakışkan RT-qPCR platformlarını kullanıyoruz.

Introduction

Tek hücrelerin gen ekspresyonu profillerinin ölçülmesi doku içinde kapsamlı henotibik heterojenite göstermiştir. Bu karmaşıklık doku fonksiyonlarını yöneten biyolojik ağları anlamamızı karmaşık hale getirmiştir. Grubumuz ve diğerleri birçok doku ve koşullarda bu fenomeni araştırdık1,2,3,4,5,6. Bu deneyler sadece gen ekspresyonu ağlarının düzenlenmesinin bu tür heterojenliğin altında yattığını değil, aynı zamanda tek hücreli çözünürlüğün doku düzeyinde çözünürlüğün takdir edemediği doku fonksiyonunda bir karmaşıklığı ortaya koyduğunu da göstermektedir. Gerçekten de, hücrelerin sadece küçük bir azınlık belirli bir durum veya meydan yanıt verebilir, ancak genel fizyoloji si bu hücrelerin etkisi önemli olabilir. Ayrıca, birden fazla hücre tipi ve dokulardan gelen yüksek boyutlu veri kümelerine çok değişkenli yöntemler uygulayan bir sistem biyolojisi yaklaşımı, sistem genelinde ki tedavi etkilerini açıklayabilir.

Bu tür veri kümelerini elde etmek için LCM ve mikroakışkan RT-qPCR’ı birleştiriyoruz. Burada floresan aktive hücre sıralama (FACS) yoluyla tek hücre toplama ve transkripsiyon ölçmek için RNA sıralama (RNA-seq) kullanarak aksine bu yaklaşımı almak. LCM’nin FACS’a göre avantajı, tek hücrelerin kesin anatomik özgüllüğünün LCM ile nispeten ve kesinlikle belgelenebilmiş olmasıdır. Ayrıca, RNA-seq rt-qPCR, mikroakışkan RT-qPCR daha az pahalı ve daha yüksek bir duyarlılık ve özgüllük7sahip daha fazla özellikleri ölçebilir iken .

Bu temsili deneyde, opioid bağımlılığı ve naltrekson-çökelmiş opioid çekilmesinin sıçan nöronal, mikroglia ve astrosit gen ekspresyonu üzerindeki etkilerini araştırdık. Dört tedavi grubu analiz edildi: 1) Plasebo, 2) Morfin, 3) Naltrekson ve 4) Çekilme(Şekil 1). Opioid bağımlılığının gen ekspresyonunu önemli ölçüde değiştirmediğini, ancak opioid yoksunluğu özellikle Tnf olmak üzere inflamatuar genlerin ekspresyonunu tetiklediğini bulduk. Astrositler en çok etkilenen hücre tipiydi. Bağırsak mikrobiyomu derinden opioid çekilmesi tarafından bteroides oranı Firmicutes bir azalma ile belirtildiği gibi etkilenmiştir, hangi bağırsak dysbiosis kurulan bir belirteçtir8,9.

Protocol

Bu çalışma Thomas Jefferson Üniversitesi ve Drexel Üniversitesi Tıp Fakültesi Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) önerileri doğrultusunda yapılmıştır. Protokol Thomas Jefferson Üniversitesi ve Drexel Üniversitesi Tıp Fakültesi IACUC tarafından onaylandı. 1. Hayvan modeli Yetişkin erkek Sprague-Dawley sıçanlarında deri altı iki 75 mg yavaş salınımlı morfin sülfat pelet veya iki plasebo pelet takın. Küçük steril cerrahi için uygun bir e…

Representative Results

Tek hücrelerin seçimi hem görsel hem de moleküler olarak doğrulandı. Hücre toplamadan önce hücresel morfoloji sigörüldü. Toplanan hücreler daha sonra QC istasyonunda görüntülendi ve hücresel çekirdek lekesi (DAPI) tek hücre seçim işareti floresanile çakıştı. Şekil 2A, CeA içeren hemisected sıçan ön beyni olan bir slaytın temsili görüntülerini gösterir. Sonraki görüntüler(Şekil 2</str…

Discussion

Tek hücreli biyoloji hücresel fenotiplerin heterojenliğini ve doku fonksiyonunun sağlamlığını göstermiştir. Bu bulgular, biyolojik sistemlerin hem makro hem de mikro ölçeklerde organizasyonu hakkında bilgi verilmiştir. Burada, anatomik özgüllük ve transkripsiyonel doğruluk sağlayan tek hücreli transkripsiyonme ölçüleri elde etmek için iki yöntem, LCM ve mikroakışkan qPCR kombinasyonunu açıklıyoruz(Şekil 1). Grubumuz bir sistem biyolojisi yaklaşımı alır ve g…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Burada sunulan çalışma NIH HLB U01 HL133360 JS ve RV, NIDA R21 DA036372 JS ve EVB ve T32 AA-007463 SJO’s destek jan Hoek verilen verildi yoluyla finanse edilmiştir.

Materials

20X DNA Binding Dye Fluidigm 100-7609 NA
2x GE Assay Loading Reagent Fluidigm 85000802-R NA
48.48 Dynamic Array IFC for Gene Expression Fluidigm BMK-M-48.48 NA
96.96 Dynamic Array IFC for Gene Expression Fluidigm BMK-M-96.96 NA
Anti-Cd11β Antibody Genway Biotech CCEC48 Microglia Stain
Anti-NeuN Antibody, clone A60 EMD Millipore MAB377 Neuronal Stain
ArcturusXT Laser Capture Microdissection System Arcturus NA NA
Biomark HD Fluidigm NA RT-qPCR platform
Bovine Serum Antigen Sigma-Aldrich B4287
CapSure Macro LCM Caps ThermoFisher Scientific LCM0211 NA
CellDirect One-Step qRT-PCR Kit ThermoFisher Scientific 11753500 Lysis buffer solution components
DAPI ThermoFisher Scientific 62248 Nucleus Stain
DNA Suspension Buffer TEKnova T0221
Exonuclease I New Englnad BioLabs, Inc. M0293S NA
ExtracSure Sample Extraction Device ThermoFisher Scientific LCM0208 NA
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides ThermoFisher Scientific 22-037-246 Plain glass slides
GeneAmp Thin-Walled Reaction Tube ThermoFisher Scientific N8010611
GFAP Monoclonal Antibody ThermoFisher Scientific A-21294 Astrocyte Stain
Goat anti-Mouse IgG (H+L), Superclonal™ Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 ThermoFisher Scientific A28175 Seconadry Antibody
IFC Controller Fluidigm NA NA
RNaseOut ThermoFisher Scientific 10777019
SsoFast EvaGreen Supermix with Low Rox Bio-Rad PN 172-5211 Rox master mix
SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit ThermoFisher Scientific 11754250 Contains VILO and SuperScript
T4 Gene 32 Protein New Englnad BioLabs, Inc. M0300S NA
TaqMan PreAmp Master Mix ThermoFisher Scientific 4391128 NA
TE Buffer TEKnova T0225 NA

References

  1. Park, J., et al. Inputs drive cell phenotype variability. Genome Research. 24, 930-941 (2014).
  2. Park, J., Ogunnaike, B., Schwaber, J., Vadigepalli, R. Identifying functional gene regulatory network phenotypes underlying single cell transcriptional variability. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 117, 87-98 (2015).
  3. Park, J., et al. Single-Cell Transcriptional Analysis Reveals Novel Neuronal Phenotypes and Interaction Networks Involved in the Central Circadian Clock. Frontiers in Neuroscience. 10, 481 (2016).
  4. O’Sullivan, S. J., et al. Single-Cell Glia and Neuron Gene Expression in the Central Amygdala in Opioid Withdrawal Suggests Inflammation With Correlated Gut Dysbiosis. Frontiers in Neuroscience. 13, 665 (2019).
  5. Buettner, F., et al. Computational analysis of cell-to-cell heterogeneity in single cell RNA-sequencing data reveals hidden subpopulations of cells. Nature Biotechnology. 33, 155-160 (2015).
  6. Papalexi, E., Satija, R. Single-cell RNA sequencing to explore immune cell heterogeneity. Nature Reviews Immunolology. 18, 35-45 (2018).
  7. SEQC/MAQC-III Consortium. A comprehensive assessment of RNA-seq accuracy, reproducibility and information content by the Sequencing Quality Control Consortium. Nature Biotechnology. 32, 903-914 (2014).
  8. Rowin, J., Xia, Y., Jung, B., Sun, J. Gut inflammation and dysbiosis in human motor neuron disease. Physiological Reports. 5, (2017).
  9. Tamboli, C. P., Neut, C., Desreumaux, P., Colombel, J. F. Dysbiosis in inflammatory bowel disease. Gut. 53, 1-4 (2004).
  10. Paxinos, G., Watson, C. . The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates: Hard Cover Edition. , (2006).

Play Video

Cite This Article
O’Sullivan, S. J., Reyes, B. A., Vadigepalli, R., Van Bockstaele, E. J., Schwaber, J. S. Combining Laser Capture Microdissection and Microfluidic qPCR to Analyze Transcriptional Profiles of Single Cells: A Systems Biology Approach to Opioid Dependence. J. Vis. Exp. (157), e60612, doi:10.3791/60612 (2020).

View Video