Vi præsenterer en protokol ved hjælp af flydende kromatografi kombineret med tandem massespektrometri at identificere og kvantificere større cellulære lipider i Saccharomyces cerevisiae. Den beskrevne metode til en kvantitativ vurdering af større lipidklasser i en gærcelle er alsidig, robust og følsom.
Lipider er strukturelt forskellige ampelagiske molekyler, der er uopløselige i vand. Lipider er væsentlige bidragydere til organiseringen og funktionen af biologiske membraner, energilagring og produktion, cellulære signalering, vesikulær transport af proteiner, organelle biogenese, og reguleret celledød. Fordi den spirende gær Saccharomyces cerevisiae er en encellet eukaryote modtagelig for grundige molekylære analyser, dens anvendelse som en model organisme hjalp afdække mekanismer, der forbinder lipid metabolisme og intracellulær transport til komplekse biologiske processer i eukaryote celler. Tilgængeligheden af en alsidig analysemetode til den robuste, følsomme og præcise kvantitative vurdering af større klasser af lipider i en gærcelle er afgørende for at få dyb indsigt i disse mekanismer. Her præsenterer vi en protokol til at bruge flydende kromatografi kombineret med tandem massespektrometri (LC-MS/MS) til kvantitativ analyse af større cellulære lipider af S. cerevisiae. Den beskrevne LC-MS/MS-metode er alsidig og robust. Det gør det muligt at identificere og kvantificere mange arter (herunder forskellige isobariske eller isomeriske former) inden for hver af de 10 lipidklasser. Denne metode er følsom og gør det muligt at identificere og kvantificere visse lipidarter ved koncentrationer helt ned til 0,2 pmol/μL. Metoden er med succes blevet anvendt til vurdering af lipidomer af hele gærceller og deres rensede organeller. Brugen af alternative mobile fase tilsætningsstoffer til elektrospray ionisering massespektrometri i denne metode kan øge effektiviteten af ionisering for nogle lipid arter og kan derfor bruges til at forbedre deres identifikation og kvantificering.
En mængde beviser tyder på, at lipider, en af de store klasser af biomolekyler, spiller væsentlige roller i mange vitale processer inden for en eukaryote celle. Disse processer omfatter samling af lipid bilag, der udgør plasmamembranen og membraner omkring cellulære organeller, transport af små molekyler på tværs af cellemembraner, reaktion på ændringer i det ekstracellulære miljø og intracellulære signal transduktion, produktion og lagring af energi, import og eksport af proteiner begrænset til forskellige organeller, vesikulær handel med proteiner i endomembranen system og protein sekretion, og flere former for reguleret celledød1 ,2,3,4,5,6,7,8,9,10.
Den spirende gær S. cerevisiae, en encellulær eukaryote organisme, er med succes blevet brugt til at afdække nogle af demekanismer,der ligger til grund for de væsentlige roller lipider i disse vitale cellulære processer4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 ,16,17,18,19,20. S. cerevisiae er en værdifuld model organisme til afdækning af disse mekanismer, fordi det er modtagelige for omfattende biokemiske, genetiske, cellebiologiske, kemiske biologiske, system biologiske, og mikrofluidisk dissektion analyser21,22,23,24,25. Yderligere fremskridt i forståelsen mekanismer, hvorigennem lipid metabolisme og intracellulære transport bidrager til disse vitale cellulære processer kræver følsomme masse spektrometri teknologier til kvantitativ karakterisering af cellulære lipidome, forståelse af lipidom molekylære kompleksitet, og integrere kvantitative lipidomics i en tværfaglig platform af systemer biologi1,2,3,26, 27,28,29,30.
De nuværende metoder for massespektrometriassisterede kvantitative lipidomik i gærceller og celler fra andre eukaryote organismer er ikke tilstrækkeligt alsidige, robuste eller følsomme. Desuden er disse metoder, der anvendes i øjeblikket, ikke i stand til at skelne mellem forskellige isobariske eller isomeriske lipidarter fra hinanden. Her beskriver vi en alsidig, robust og følsom metode, der tillader brug af flydende kromatografi kombineret med tandem massespektrometri (LC-MS/MS) til kvantitativ analyse af større cellulære lipider af S. cerevisiae.
Følgende forholdsregler er vigtige for en vellykket gennemførelse af den protokol, der er beskrevet her:
1. Chloroform og methanol er giftige. De effektivt udtrække forskellige stoffer fra overflader, herunder laboratorium plastudstyr og din hud. Derfor håndteredisse organiske opløsningsmidler med forsigtighed ved at undgå brug af plast i trin, der involverer kontakt med chloroform og / eller methanol, ved hjælp af borosilikat glas pipetter til disse trin, og skylning disse pipetter med…
The authors have nothing to disclose.
Vi er taknemmelige over for nuværende og tidligere medlemmer af Titorenko-laboratoriet for drøftelser. Vi anerkender Center for Biologisk Anvendelse af Massespektrometri og Center for Strukturel og Funktionel Genomics (begge på Concordia University) for fremragende ydelser. Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) i Canada (RGPIN 2014-04482) og Concordia University Chair Fund (CC0113). K.M. blev støttet af Concordia University Merit Award.
15 mL High-speed glass centrifuge tubes with Teflon lined caps | PYREX | 05-550 | |
2 mL Glass sample vials with Teflon lined caps | Fisher Scientific | 60180A-SV9-1P | |
2-Propanol | Fisher Scientific | A461-500 | |
Acetonitrile | Fisher Scientific | A9554 | |
Agilent 1100 series LC system | Agilent Technologies | G1312A | |
Agilent1100 Wellplate | Agilent Technologies | G1367A | |
Ammonium acetate | Fisher Scientific | A11450 | |
Ammonium bicarbonate | Sigma | 9830 | |
Ammonium formate | Fisher Scientific | A11550 | |
Ammonium hydroxide | Fisher Scientific | A470-250 | |
Bactopeptone | Fisher Scientific | BP1420-2 | |
Cardiolipin | Avanti Polar Lipids | 750332 | |
Centra CL2 clinical centrifuge | Thermo Scientific | 004260F | |
Ceramide | Avanti Polar Lipids | 860517 | |
Chloroform | Fisher Scientific | C297-4 | |
CSH C18 VanGuard | Waters | 186006944 | Pre-column system |
Free fatty acid (19:0) | Matreya | 1028 | |
Glass beads (acid-washed, 425-600 μM) | Sigma-Aldrich | G8772 | |
Glucose | Fisher Scientific | D16-10 | |
Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
L-histidine | Sigma | H8125 | |
Lipid Search software (V4.1) | Fisher Scientific | V4.1 | LC-MS/MS analysis software |
L-leucine | Sigma | L8912 | |
L-lysine | Sigma | L5501 | |
Methanol | Fisher Scientific | A4564 | |
Phosphatidylcholine | Avanti Polar Lipids | 850340 | |
Phosphatidylethanolamine | Avanti Polar Lipids | 850704 | |
Phosphatidylglycerol | Avanti Polar Lipids | 840446 | |
Phosphatidylinositol | Avanti Polar Lipids | LM1502 | |
Phosphatidylserine | Avanti Polar Lipids | 840028 | |
Reverse-phase column CSH C18 | Waters | 186006102 | |
Sphingosine | Avanti Polar Lipids | 860669 | |
Thermo Orbitrap Velos MS | Fisher Scientific | ETD-10600 | |
Tricylglycerol | Larodan, Malmo | TAG Mixed FA | |
Ultrasonic sonicator | Fisher Scientific | 15337416 | |
Uracil | Sigma | U0750 | |
Vortex | Fisher Scientific | 2215365 | |
Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-2 | |
Yeast nitrogen base without amino acids | Fisher Scientific | DF0919-15-3 | |
Yeast strain BY4742 | Dharmacon | YSC1049 |