Kvantitativ analyse af cellulære lipidom af Saccharomyces Cerevisiae Ved hjælp af flydende kromatografi kombineret med tandem massespektrometri
Summary
Vi præsenterer en protokol ved hjælp af flydende kromatografi kombineret med tandem massespektrometri at identificere og kvantificere større cellulære lipider i Saccharomyces cerevisiae. Den beskrevne metode til en kvantitativ vurdering af større lipidklasser i en gærcelle er alsidig, robust og følsom.
Abstract
Lipider er strukturelt forskellige ampelagiske molekyler, der er uopløselige i vand. Lipider er væsentlige bidragydere til organiseringen og funktionen af biologiske membraner, energilagring og produktion, cellulære signalering, vesikulær transport af proteiner, organelle biogenese, og reguleret celledød. Fordi den spirende gær Saccharomyces cerevisiae er en encellet eukaryote modtagelig for grundige molekylære analyser, dens anvendelse som en model organisme hjalp afdække mekanismer, der forbinder lipid metabolisme og intracellulær transport til komplekse biologiske processer i eukaryote celler. Tilgængeligheden af en alsidig analysemetode til den robuste, følsomme og præcise kvantitative vurdering af større klasser af lipider i en gærcelle er afgørende for at få dyb indsigt i disse mekanismer. Her præsenterer vi en protokol til at bruge flydende kromatografi kombineret med tandem massespektrometri (LC-MS/MS) til kvantitativ analyse af større cellulære lipider af S. cerevisiae. Den beskrevne LC-MS/MS-metode er alsidig og robust. Det gør det muligt at identificere og kvantificere mange arter (herunder forskellige isobariske eller isomeriske former) inden for hver af de 10 lipidklasser. Denne metode er følsom og gør det muligt at identificere og kvantificere visse lipidarter ved koncentrationer helt ned til 0,2 pmol/μL. Metoden er med succes blevet anvendt til vurdering af lipidomer af hele gærceller og deres rensede organeller. Brugen af alternative mobile fase tilsætningsstoffer til elektrospray ionisering massespektrometri i denne metode kan øge effektiviteten af ionisering for nogle lipid arter og kan derfor bruges til at forbedre deres identifikation og kvantificering.
Introduction
En mængde beviser tyder på, at lipider, en af de store klasser af biomolekyler, spiller væsentlige roller i mange vitale processer inden for en eukaryote celle. Disse processer omfatter samling af lipid bilag, der udgør plasmamembranen og membraner omkring cellulære organeller, transport af små molekyler på tværs af cellemembraner, reaktion på ændringer i det ekstracellulære miljø og intracellulære signal transduktion, produktion og lagring af energi, import og eksport af proteiner begrænset til forskellige organeller, vesikulær handel med proteiner i endomembranen system og protein sekretion, og flere former for reguleret celledød1 ,2,3,4,5,6,7,8,9,10.
Den spirende gær S. cerevisiae, en encellulær eukaryote organisme, er med succes blevet brugt til at afdække nogle af demekanismer,der ligger til grund for de væsentlige roller lipider i disse vitale cellulære processer4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 ,16,17,18,19,20. S. cerevisiae er en værdifuld model organisme til afdækning af disse mekanismer, fordi det er modtagelige for omfattende biokemiske, genetiske, cellebiologiske, kemiske biologiske, system biologiske, og mikrofluidisk dissektion analyser21,22,23,24,25. Yderligere fremskridt i forståelsen mekanismer, hvorigennem lipid metabolisme og intracellulære transport bidrager til disse vitale cellulære processer kræver følsomme masse spektrometri teknologier til kvantitativ karakterisering af cellulære lipidome, forståelse af lipidom molekylære kompleksitet, og integrere kvantitative lipidomics i en tværfaglig platform af systemer biologi1,2,3,26, 27,28,29,30.
De nuværende metoder for massespektrometriassisterede kvantitative lipidomik i gærceller og celler fra andre eukaryote organismer er ikke tilstrækkeligt alsidige, robuste eller følsomme. Desuden er disse metoder, der anvendes i øjeblikket, ikke i stand til at skelne mellem forskellige isobariske eller isomeriske lipidarter fra hinanden. Her beskriver vi en alsidig, robust og følsom metode, der tillader brug af flydende kromatografi kombineret med tandem massespektrometri (LC-MS/MS) til kvantitativ analyse af større cellulære lipider af S. cerevisiae.
Protocol
Representative Results
Discussion
Følgende forholdsregler er vigtige for en vellykket gennemførelse af den protokol, der er beskrevet her:
1. Chloroform og methanol er giftige. De effektivt udtrække forskellige stoffer fra overflader, herunder laboratorium plastudstyr og din hud. Derfor håndteredisse organiske opløsningsmidler med forsigtighed ved at undgå brug af plast i trin, der involverer kontakt med chloroform og / eller methanol, ved hjælp af borosilikat glas pipetter til disse trin, og skylning disse pipetter med…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi er taknemmelige over for nuværende og tidligere medlemmer af Titorenko-laboratoriet for drøftelser. Vi anerkender Center for Biologisk Anvendelse af Massespektrometri og Center for Strukturel og Funktionel Genomics (begge på Concordia University) for fremragende ydelser. Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) i Canada (RGPIN 2014-04482) og Concordia University Chair Fund (CC0113). K.M. blev støttet af Concordia University Merit Award.
Materials
| 15 mL High-speed glass centrifuge tubes with Teflon lined caps | PYREX | 05-550 | |
| 2 mL Glass sample vials with Teflon lined caps | Fisher Scientific | 60180A-SV9-1P | |
| 2-Propanol | Fisher Scientific | A461-500 | |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | A9554 | |
| Agilent 1100 series LC system | Agilent Technologies | G1312A | |
| Agilent1100 Wellplate | Agilent Technologies | G1367A | |
| Ammonium acetate | Fisher Scientific | A11450 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma | 9830 | |
| Ammonium formate | Fisher Scientific | A11550 | |
| Ammonium hydroxide | Fisher Scientific | A470-250 | |
| Bactopeptone | Fisher Scientific | BP1420-2 | |
| Cardiolipin | Avanti Polar Lipids | 750332 | |
| Centra CL2 clinical centrifuge | Thermo Scientific | 004260F | |
| Ceramide | Avanti Polar Lipids | 860517 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | C297-4 | |
| CSH C18 VanGuard | Waters | 186006944 | Pre-column system |
| Free fatty acid (19:0) | Matreya | 1028 | |
| Glass beads (acid-washed, 425-600 μM) | Sigma-Aldrich | G8772 | |
| Glucose | Fisher Scientific | D16-10 | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| L-histidine | Sigma | H8125 | |
| Lipid Search software (V4.1) | Fisher Scientific | V4.1 | LC-MS/MS analysis software |
| L-leucine | Sigma | L8912 | |
| L-lysine | Sigma | L5501 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A4564 | |
| Phosphatidylcholine | Avanti Polar Lipids | 850340 | |
| Phosphatidylethanolamine | Avanti Polar Lipids | 850704 | |
| Phosphatidylglycerol | Avanti Polar Lipids | 840446 | |
| Phosphatidylinositol | Avanti Polar Lipids | LM1502 | |
| Phosphatidylserine | Avanti Polar Lipids | 840028 | |
| Reverse-phase column CSH C18 | Waters | 186006102 | |
| Sphingosine | Avanti Polar Lipids | 860669 | |
| Thermo Orbitrap Velos MS | Fisher Scientific | ETD-10600 | |
| Tricylglycerol | Larodan, Malmo | TAG Mixed FA | |
| Ultrasonic sonicator | Fisher Scientific | 15337416 | |
| Uracil | Sigma | U0750 | |
| Vortex | Fisher Scientific | 2215365 | |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-2 | |
| Yeast nitrogen base without amino acids | Fisher Scientific | DF0919-15-3 | |
| Yeast strain BY4742 | Dharmacon | YSC1049 |
References
- Bou Khalil, M., et al. Lipidomics era: accomplishments and challenges. Mass Spectrometry Review. 29 (6), 877-929 (2010).
- Shevchenko, A., Simons, K. Lipidomics: coming to grips with lipid diversity. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (8), 593-598 (2010).
- Brügger, B. Lipidomics: analysis of the lipid composition of cells and subcellular organelles by electrospray ionization mass spectrometry. Annual Review of Biochemistry. 83, 79-98 (2014).
- Zechner, R., et al. FAT SIGNALS – lipases and lipolysis in lipid metabolism and signaling. Cell Metabolism. 15 (3), 279-291 (2012).
- Eisenberg, T., Büttner, S. Lipids and cell death in yeast. FEMS Yeast Research. 14 (1), 179-197 (2014).
- Richard, V. R., et al. Mechanism of liponecrosis, a distinct mode of programmed cell death. Cell Cycle. 13 (23), 3707-3726 (2014).
- Arlia-Ciommo, A., Svistkova, V., Mohtashami, S., Titorenko, V. I. A novel approach to the discovery of anti-tumor pharmaceuticals: searching for activators of liponecrosis. Oncotarget. 7 (5), 5204-5225 (2016).
- Mårtensson, C. U., Doan, K. N., Becker, T. Effects of lipids on mitochondrial functions. Biochimica et Biophysica Acta. 1862 (1), 102-113 (2017).
- Basu Ball, W., Neff, J. K., Gohil, V. M. The role of non-bilayer phospholipids in mitochondrial structure and function. FEBS Letters. 592 (8), 1273-1290 (2018).
- Thakur, R., Naik, A., Panda, A., Raghu, P. Regulation of membrane turnover by phosphatidic acid: cellular functions and disease implications. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 83 (2019).
- Goldberg, A. A., et al. A novel function of lipid droplets in regulating longevity. Biochemical Society Transactions. 37 (5), 1050-1055 (2009).
- Kohlwein, S. D. Obese and anorexic yeasts: experimental models to understand the metabolic syndrome and lipotoxicity. Biochimica et Biophysica Acta. 1801 (3), 222-229 (2010).
- Titorenko, V. I., Terlecky, S. R. Peroxisome metabolism and cellular aging. Traffic. 12 (3), 252-259 (2011).
- Henry, S. A., Kohlwein, S. D., Carman, G. M. Metabolism and regulation of glycerolipids in the yeast Saccharomyces cerevisiae. 유전학. 190 (2), 317-349 (2012).
- Kohlwein, S. D., Veenhuis, M., vander Klei, I. J. Lipid droplets and peroxisomes: key players in cellular lipid homeostasis or a matter of fat–store ’em up or burn ’em down. 유전학. 193 (1), 1-50 (2013).
- Baile, M. G., Lu, Y. W., Claypool, S. M. The topology and regulation of cardiolipin biosynthesis and remodeling in yeast. Chemistry and Physics of Lipids. 179, 25-31 (2014).
- Dimmer, K. S., Rapaport, D. Mitochondrial contact sites as platforms for phospholipid exchange. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (1), 69-80 (2017).
- Csordás, G., Weaver, D., Hajnóczky, G. Endoplasmic reticulum-mitochondrial contactology: structure and signaling functions. Trends in Cell Biology. 28 (7), 523-540 (2018).
- Mitrofanova, D., et al. Lipid metabolism and transport define longevity of the yeast Saccharomyces cerevisiae. Frontiers in Bioscience (Landmark Edition). 23, 1166-1194 (2018).
- Tamura, Y., Kawano, S., Endo, T. Organelle contact zones as sites for lipid transfer. Journal of Biochemistry. 165 (2), 115-123 (2019).
- Weissman, J., Guthrie, C., Fink, G. R. . Guide to Yeast Genetics: Functional Genomics, Proteomics, and Other Systems Analyses. , (2010).
- Botstein, D., Fink, G. R. Yeast: an experimental organism for 21st Century biology. 유전학. 189 (3), 695-704 (2011).
- Duina, A. A., Miller, M. E., Keeney, J. B. Budding yeast for budding geneticists: a primer on the Saccharomyces cerevisiae model system. 유전학. 197 (1), 33-48 (2014).
- Strynatka, K. A., Gurrola-Gal, M. C., Berman, J. N., McMaster, C. R. How surrogate and chemical genetics in model organisms can suggest therapies for human genetic diseases. 유전학. 208 (3), 833-851 (2018).
- Zimmermann, A., et al. Yeast as a tool to identify anti-aging compounds. FEMS Yeast Research. 18 (6), (2018).
- Ejsing, C. S., et al. Global analysis of the yeast lipidome by quantitative shotgun mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (7), 2136-2141 (2009).
- Guan, X. L., Riezman, I., Wenk, M. R., Riezman, H. Yeast lipid analysis and quantification by mass spectrometry. Methods in Enzymology. 470, 369-391 (2010).
- Guan, X. L., et al. Biochemical membrane lipidomics during Drosophila development. Developmental Cell. 24 (1), 98-111 (2013).
- Klose, C., Tarasov, K. Profiling of yeast lipids by shotgun lipidomics. Methods in Molecular Biology. 1361, 309-324 (2016).
- Wang, M., Wang, C., Han, R. H., Han, X. Novel advances in shotgun lipidomics for biology and medicine. Progress in Lipid Research. 61, 83-108 (2016).
- Sud, M., et al. LMSD: LIPID MAPS structure database. Nucleic Acids Research. 35 (Database issue), D527-D532 (2007).
- Pauling, J. K., et al. Proposal for a common nomenclature for fragment ions in mass spectra of lipids. PLoS One. 12 (11), e0188394 (2017).
