Analisi quantitativa del Lipidome cellulare di Saccharomyces Cerevisiae Utilizzando la cromatografia Liquida Accoppiata con la Spettrometria di Massa Tandem
Summary
Vi presentiamo un protocollo che utilizza la cromatografia liquida accoppiata con la spettrometria di massa tandem per identificare e quantificare i principali lipidi cellulari in Saccharomyces cerevisiae. Il metodo descritto per una valutazione quantitativa delle principali classi lipidiche all’interno di una cellula di lievito è versatile, robusto e sensibile.
Abstract
I lipidi sono molecole anfipatiche strutturalmente diverse che sono insolubili in acqua. I lipidi sono contributori essenziali all’organizzazione e alla funzione delle membrane biologiche, dello stoccaggio e della produzione di energia, della segnalazione cellulare, del trasporto vescicolare delle proteine, della biogenesi dell’orgelli e della morte cellulare regolata. Poiché il lievito in erba Saccharomyces cerevisiae è un euaryote unicellulare che consente di analizzare molecolari approfondite, il suo uso come organismo modello ha contribuito a scoprire meccanismi che collegano il metabolismo dei lipidi e il trasporto intracellulare a complessi processi biologici all’interno di cellule eucariotiche. La disponibilità di un metodo analitico versatile per una valutazione quantitativa robusta, sensibile e accurata delle principali classi di lipidi all’interno di una cellula di lievito è fondamentale per ottenere informazioni approfondite su questi meccanismi. Qui presentiamo un protocollo per utilizzare la cromatografia liquida accoppiata con la spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS) per l’analisi quantitativa dei principali lipidi cellulari di S. cerevisiae. Il metodo LC-MS/MS descritto è versatile e robusto. Consente l’identificazione e la quantificazione di numerose specie (comprese diverse forme isobariche o isomeriche) all’interno di ciascuna delle classi di 10 lipidi. Questo metodo è sensibile e consente l’identificazione e la quantificazione di alcune specie di lipidi a concentrazioni a partire da 0,2 pmol/L. Il metodo è stato applicato con successo alla valutazione dei lipidomi delle cellule intere del lievito e dei loro organelli purificati. L’uso di additivi alternativi di fase mobile per la spettrometria di massa di ionizzazione elettrospray in questo metodo può aumentare l’efficienza della ionizzazione per alcune specie lipidiche e può quindi essere utilizzato per migliorarne l’identificazione e la quantitazione.
Introduction
Un insieme di prove indica che i lipidi, una delle principali classi di biomolecole, svolgono un ruolo essenziale in molti processi vitali all’interno di una cellula eucarome. Questi processi includono l’assemblaggio di bistrati lipidici che costituiscono la membrana plasmatica e le membrane che circondano gli organelli cellulari, il trasporto di piccole molecole attraverso le membrane cellulari, la risposta ai cambiamenti nell’ambiente extracellulare e la trasduzione del segnale intracellulare, la generazione e lo stoccaggio dell’energia, l’importazione e l’esportazione di proteine confinate a diversi organelli, il traffico vescicolare di proteine all’interno del sistema endomembrana e della segreteria delle proteine, e diversi modi regolati di morte cellulare1 ,2,3,4,5,6,7,8,9,10.
Il lievito in erba S. cerevisiae, un organismo eucariotico unicellulare, è stato utilizzato con successo per scoprire alcuni dei meccanismi alla base dei ruoli essenziali dei lipidi in questi processi cellulari vitali4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 ,16,17,18,19,20. S. cerevisiae è un organismo modello prezioso per scoprire questi meccanismi perché è suscettibile di biochimica completa, genetica, cellula biologica, biologica chimica, sistema biologica, e microfluidica dissezione analisi21,22,23,24,25. Ulteriori progressi nella comprensione dei meccanismi attraverso i quali il metabolismo lipidico e il trasporto intracellulare contribuiscono a questi processi cellulari vitali richiedono tecnologie sensibili di spettrometria di massa per la caratterizzazione quantitativa del lipidome cellulare, la comprensione della complessità molecolare lipidoma e l’integrazione della lipidomica quantitativa in una piattaforma multidisciplinare della biologia dei sistemi1,2,3,26, 27,28,29,30.
Gli attuali metodi per la lipidomica quantitativa assistita dalla spettrometria di massa delle cellule di lievito e delle cellule di altri organismi eucarioti non sono sufficientemente versatili, robusti o sensibili. Inoltre, questi metodi attualmente utilizzati non sono in grado di distinguere varie specie di lipidi isobarici o isomeriche l’una dall’altra. Qui descriviamo un metodo versatile, robusto e sensibile che permette l’uso di cromatografia liquida accoppiata con spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS) per l’analisi quantitativa dei principali lipidi cellulari di S. cerevisiae.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le seguenti precauzioni sono importanti per la corretta implementazione del protocollo descritto di seguito:
1. Il cloroformio e il metanolo sono tossici. Estraggono in modo efficiente varie sostanze dalle superfici, tra cui plasticware di laboratorio e la pelle. Pertanto, gestire questi solventi organici con cautela evitando l’uso di materie plastiche in passaggi che comportano il contatto con cloroformio e/o metanolo, utilizzando pipette di vetro borosilicato per questi passaggi e risciacqua…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Siamo grati agli attuali ed ex membri del laboratorio Titorenko per le discussioni. Riconosciamo il Centro per le applicazioni biologiche della spettrometria di massa e il Centro per la genomica strutturale e funzionale (entrambe all’Università di Concordia) per i servizi eccezionali. Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni del Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) del Canada (RGPIN 2014-04482) e del Concordia University Chair Fund (CC0113). K.M. è stato sostenuto dal Concordia University Merit Award.
Materials
| 15 mL High-speed glass centrifuge tubes with Teflon lined caps | PYREX | 05-550 | |
| 2 mL Glass sample vials with Teflon lined caps | Fisher Scientific | 60180A-SV9-1P | |
| 2-Propanol | Fisher Scientific | A461-500 | |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | A9554 | |
| Agilent 1100 series LC system | Agilent Technologies | G1312A | |
| Agilent1100 Wellplate | Agilent Technologies | G1367A | |
| Ammonium acetate | Fisher Scientific | A11450 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma | 9830 | |
| Ammonium formate | Fisher Scientific | A11550 | |
| Ammonium hydroxide | Fisher Scientific | A470-250 | |
| Bactopeptone | Fisher Scientific | BP1420-2 | |
| Cardiolipin | Avanti Polar Lipids | 750332 | |
| Centra CL2 clinical centrifuge | Thermo Scientific | 004260F | |
| Ceramide | Avanti Polar Lipids | 860517 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | C297-4 | |
| CSH C18 VanGuard | Waters | 186006944 | Pre-column system |
| Free fatty acid (19:0) | Matreya | 1028 | |
| Glass beads (acid-washed, 425-600 μM) | Sigma-Aldrich | G8772 | |
| Glucose | Fisher Scientific | D16-10 | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| L-histidine | Sigma | H8125 | |
| Lipid Search software (V4.1) | Fisher Scientific | V4.1 | LC-MS/MS analysis software |
| L-leucine | Sigma | L8912 | |
| L-lysine | Sigma | L5501 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A4564 | |
| Phosphatidylcholine | Avanti Polar Lipids | 850340 | |
| Phosphatidylethanolamine | Avanti Polar Lipids | 850704 | |
| Phosphatidylglycerol | Avanti Polar Lipids | 840446 | |
| Phosphatidylinositol | Avanti Polar Lipids | LM1502 | |
| Phosphatidylserine | Avanti Polar Lipids | 840028 | |
| Reverse-phase column CSH C18 | Waters | 186006102 | |
| Sphingosine | Avanti Polar Lipids | 860669 | |
| Thermo Orbitrap Velos MS | Fisher Scientific | ETD-10600 | |
| Tricylglycerol | Larodan, Malmo | TAG Mixed FA | |
| Ultrasonic sonicator | Fisher Scientific | 15337416 | |
| Uracil | Sigma | U0750 | |
| Vortex | Fisher Scientific | 2215365 | |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-2 | |
| Yeast nitrogen base without amino acids | Fisher Scientific | DF0919-15-3 | |
| Yeast strain BY4742 | Dharmacon | YSC1049 |
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