Kvantitativ analyse av cellulær lipidom eav saccharomyces cerevisiae ved hjelp av flytende kromatografi kombinert med tandem massespektrometri
Summary
Vi presenterer en protokoll ved hjelp av flytende kromatografi kombinert med tandem massespektrometri for å identifisere og kvantifisere store cellulære lipider i Sakkarincerevisiae. Den beskrevne metoden for en kvantitativ vurdering av store lipidklasser i en gjærcelle er allsidig, robust og følsom.
Abstract
Lipider er strukturelt varierte amhiptaiske molekyler som er uoppløselige i vann. Lipider er viktige bidragsytere til organiseringen og funksjonen til biologiske membraner, energilagring og produksjon, cellulær signalering, vesikulær transport av proteiner, organelle biogenese og regulert celledød. Fordi den spirende gjærSaccharomyces cerevisiae er en encellulær eukaryote mottagelig for grundige molekylære analyser, hjalp bruken som modellorganisme avdekke mekanismer som knytter lipidmetabolisme og intracellulær transport til komplekse biologiske prosesser innen eukaryyotiske celler. Tilgjengeligheten av en allsidig analytisk metode for robust, sensitiv og nøyaktig kvantitativ vurdering av store klasser av lipider i en gjærcelle er avgjørende for å få dyp innsikt i disse mekanismene. Her presenterer vi en protokoll for å bruke flytende kromatografi kombinert med tandem massespektrometri (LC-MS/MS) for kvantitativ analyse av store cellulære lipider av S. cerevisiae. LC-MS/MS-metoden som er beskrevet er allsidig og robust. Det muliggjør identifisering og kvantifisering av mange arter (inkludert forskjellige isobariske eller isomeriske former) i hver av de 10 lipidklassene. Denne metoden er følsom og tillater identifisering og kvantitet av noen lipidarter ved konsentrasjoner så lavt som 0,2 pmol/μL. Metoden har blitt brukt til å vurdere lipidomer av hele gjærceller og deres rensede organeller. Bruken av alternative mobile fase tilsetningsstoffer for elektrospray ionisering massespektrometri i denne metoden kan øke effektiviteten av ionisering for noen lipid arter og kan derfor brukes til å forbedre deres identifikasjon og kvantitet.
Introduction
En mengde bevis indikerer at lipider, en av de store klassene av biomolekyler, spiller viktige roller i mange viktige prosesser i en eukaryotisk celle. Disse prosessene inkluderer montering av lipidbilag som utgjør plasmamembranen og membranene rundt cellulære organeller, transport av små molekyler på tvers av cellemembraner, respons på endringer i det ekstracellulære miljøet og intracellulær signaltransduksjon, generering og lagring av energi, import og eksport av proteiner begrenset til forskjellige organeller, vesikulær smugling av proteiner i endomembransystemet og proteinsekresjon, og flere moduser regulert celledød1 ,2,3,4,5,6,7,8,9,10.
Den spirende gjær S. cerevisiae, en encellulær eukalær organisme, har blitt brukt til å avdekke noen av mekanismene som ligger til grunn for de essensielle rollene til lipider i disse vitale cellulære prosessene4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 ,16,17,18,19,20. S. cerevisiae er en verdifull modell organisme for å avdekke disse mekanismene fordi det er mottagelig for omfattende biokjemiske, genetiske, celle biologiske, kjemiskbiologiske, system biologiske og mikrofluidiske disseksjonsanalyser21,22,23,24,25. Videre fremgang i å forstå mekanismer der lipidmetabolisme og intracellulær transport bidrar til disse vitale cellulære prosessene krever sensitiv massespektrometriteknologi er for kvantitativ karakterisering av cellulær lipidom, forståelse av lipidommolekylær kompleksitet og integrering av kvantitative lipidomikk i en tverrfaglig plattform av systembiologi1,2,3,26, 27,28,29,30.
Nåværende metoder for massespektrometriassistertkvantitative lipidomics av gjærceller og celler av andre eukaryyotiske organismer er ikke tilstrekkelig allsidige, robuste eller følsomme. Videre er disse brukte metodene i dag ikke i stand til å skille ulike isobariske eller isomeric lipid arter fra hverandre. Her beskriver vi en allsidig, robust og sensitiv metode som tillater bruk av flytende kromatografi kombinert med tandemmassespektrometri (LC-MS/MS) for kvantitativ analyse av store cellulære lipider av S. cerevisiae.
Protocol
Representative Results
Discussion
Følgende forholdsregler er viktige for vellykket gjennomføring av protokollen som er beskrevet her:
1. Kloroform og metanol er giftige. De trekker effektivt ut ulike stoffer fra overflater, inkludert laboratorieplasttøy og huden din. Håndter derfor disse organiske løsemidlene med forsiktighet ved å unngå bruk av plast i trinn som involverer kontakt med kloroform og/eller metanol, ved hjelp av borosilikatglasspipetter for disse trinnene, og sner disse pipetter med kloroform og metanol f?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi er takknemlige til nåværende og tidligere medlemmer av Titorenko-laboratoriet for diskusjoner. Vi anerkjenner Senter for biologiske anvendelser av massespektrometri og Senter for strukturell og funksjonell genomikk (begge ved Concordia University) for fremragende tjenester. Denne studien ble støttet av tilskudd fra Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) i Canada (RGPIN 2014-04482) og Concordia University Chair Fund (CC0113). K.M. ble støttet av Concordia University Merit Award.
Materials
| 15 mL High-speed glass centrifuge tubes with Teflon lined caps | PYREX | 05-550 | |
| 2 mL Glass sample vials with Teflon lined caps | Fisher Scientific | 60180A-SV9-1P | |
| 2-Propanol | Fisher Scientific | A461-500 | |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | A9554 | |
| Agilent 1100 series LC system | Agilent Technologies | G1312A | |
| Agilent1100 Wellplate | Agilent Technologies | G1367A | |
| Ammonium acetate | Fisher Scientific | A11450 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma | 9830 | |
| Ammonium formate | Fisher Scientific | A11550 | |
| Ammonium hydroxide | Fisher Scientific | A470-250 | |
| Bactopeptone | Fisher Scientific | BP1420-2 | |
| Cardiolipin | Avanti Polar Lipids | 750332 | |
| Centra CL2 clinical centrifuge | Thermo Scientific | 004260F | |
| Ceramide | Avanti Polar Lipids | 860517 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | C297-4 | |
| CSH C18 VanGuard | Waters | 186006944 | Pre-column system |
| Free fatty acid (19:0) | Matreya | 1028 | |
| Glass beads (acid-washed, 425-600 μM) | Sigma-Aldrich | G8772 | |
| Glucose | Fisher Scientific | D16-10 | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| L-histidine | Sigma | H8125 | |
| Lipid Search software (V4.1) | Fisher Scientific | V4.1 | LC-MS/MS analysis software |
| L-leucine | Sigma | L8912 | |
| L-lysine | Sigma | L5501 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A4564 | |
| Phosphatidylcholine | Avanti Polar Lipids | 850340 | |
| Phosphatidylethanolamine | Avanti Polar Lipids | 850704 | |
| Phosphatidylglycerol | Avanti Polar Lipids | 840446 | |
| Phosphatidylinositol | Avanti Polar Lipids | LM1502 | |
| Phosphatidylserine | Avanti Polar Lipids | 840028 | |
| Reverse-phase column CSH C18 | Waters | 186006102 | |
| Sphingosine | Avanti Polar Lipids | 860669 | |
| Thermo Orbitrap Velos MS | Fisher Scientific | ETD-10600 | |
| Tricylglycerol | Larodan, Malmo | TAG Mixed FA | |
| Ultrasonic sonicator | Fisher Scientific | 15337416 | |
| Uracil | Sigma | U0750 | |
| Vortex | Fisher Scientific | 2215365 | |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-2 | |
| Yeast nitrogen base without amino acids | Fisher Scientific | DF0919-15-3 | |
| Yeast strain BY4742 | Dharmacon | YSC1049 |
References
- Bou Khalil, M., et al. Lipidomics era: accomplishments and challenges. Mass Spectrometry Review. 29 (6), 877-929 (2010).
- Shevchenko, A., Simons, K. Lipidomics: coming to grips with lipid diversity. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (8), 593-598 (2010).
- Brügger, B. Lipidomics: analysis of the lipid composition of cells and subcellular organelles by electrospray ionization mass spectrometry. Annual Review of Biochemistry. 83, 79-98 (2014).
- Zechner, R., et al. FAT SIGNALS – lipases and lipolysis in lipid metabolism and signaling. Cell Metabolism. 15 (3), 279-291 (2012).
- Eisenberg, T., Büttner, S. Lipids and cell death in yeast. FEMS Yeast Research. 14 (1), 179-197 (2014).
- Richard, V. R., et al. Mechanism of liponecrosis, a distinct mode of programmed cell death. Cell Cycle. 13 (23), 3707-3726 (2014).
- Arlia-Ciommo, A., Svistkova, V., Mohtashami, S., Titorenko, V. I. A novel approach to the discovery of anti-tumor pharmaceuticals: searching for activators of liponecrosis. Oncotarget. 7 (5), 5204-5225 (2016).
- Mårtensson, C. U., Doan, K. N., Becker, T. Effects of lipids on mitochondrial functions. Biochimica et Biophysica Acta. 1862 (1), 102-113 (2017).
- Basu Ball, W., Neff, J. K., Gohil, V. M. The role of non-bilayer phospholipids in mitochondrial structure and function. FEBS Letters. 592 (8), 1273-1290 (2018).
- Thakur, R., Naik, A., Panda, A., Raghu, P. Regulation of membrane turnover by phosphatidic acid: cellular functions and disease implications. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 83 (2019).
- Goldberg, A. A., et al. A novel function of lipid droplets in regulating longevity. Biochemical Society Transactions. 37 (5), 1050-1055 (2009).
- Kohlwein, S. D. Obese and anorexic yeasts: experimental models to understand the metabolic syndrome and lipotoxicity. Biochimica et Biophysica Acta. 1801 (3), 222-229 (2010).
- Titorenko, V. I., Terlecky, S. R. Peroxisome metabolism and cellular aging. Traffic. 12 (3), 252-259 (2011).
- Henry, S. A., Kohlwein, S. D., Carman, G. M. Metabolism and regulation of glycerolipids in the yeast Saccharomyces cerevisiae. 유전학. 190 (2), 317-349 (2012).
- Kohlwein, S. D., Veenhuis, M., vander Klei, I. J. Lipid droplets and peroxisomes: key players in cellular lipid homeostasis or a matter of fat–store ’em up or burn ’em down. 유전학. 193 (1), 1-50 (2013).
- Baile, M. G., Lu, Y. W., Claypool, S. M. The topology and regulation of cardiolipin biosynthesis and remodeling in yeast. Chemistry and Physics of Lipids. 179, 25-31 (2014).
- Dimmer, K. S., Rapaport, D. Mitochondrial contact sites as platforms for phospholipid exchange. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (1), 69-80 (2017).
- Csordás, G., Weaver, D., Hajnóczky, G. Endoplasmic reticulum-mitochondrial contactology: structure and signaling functions. Trends in Cell Biology. 28 (7), 523-540 (2018).
- Mitrofanova, D., et al. Lipid metabolism and transport define longevity of the yeast Saccharomyces cerevisiae. Frontiers in Bioscience (Landmark Edition). 23, 1166-1194 (2018).
- Tamura, Y., Kawano, S., Endo, T. Organelle contact zones as sites for lipid transfer. Journal of Biochemistry. 165 (2), 115-123 (2019).
- Weissman, J., Guthrie, C., Fink, G. R. . Guide to Yeast Genetics: Functional Genomics, Proteomics, and Other Systems Analyses. , (2010).
- Botstein, D., Fink, G. R. Yeast: an experimental organism for 21st Century biology. 유전학. 189 (3), 695-704 (2011).
- Duina, A. A., Miller, M. E., Keeney, J. B. Budding yeast for budding geneticists: a primer on the Saccharomyces cerevisiae model system. 유전학. 197 (1), 33-48 (2014).
- Strynatka, K. A., Gurrola-Gal, M. C., Berman, J. N., McMaster, C. R. How surrogate and chemical genetics in model organisms can suggest therapies for human genetic diseases. 유전학. 208 (3), 833-851 (2018).
- Zimmermann, A., et al. Yeast as a tool to identify anti-aging compounds. FEMS Yeast Research. 18 (6), (2018).
- Ejsing, C. S., et al. Global analysis of the yeast lipidome by quantitative shotgun mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (7), 2136-2141 (2009).
- Guan, X. L., Riezman, I., Wenk, M. R., Riezman, H. Yeast lipid analysis and quantification by mass spectrometry. Methods in Enzymology. 470, 369-391 (2010).
- Guan, X. L., et al. Biochemical membrane lipidomics during Drosophila development. Developmental Cell. 24 (1), 98-111 (2013).
- Klose, C., Tarasov, K. Profiling of yeast lipids by shotgun lipidomics. Methods in Molecular Biology. 1361, 309-324 (2016).
- Wang, M., Wang, C., Han, R. H., Han, X. Novel advances in shotgun lipidomics for biology and medicine. Progress in Lipid Research. 61, 83-108 (2016).
- Sud, M., et al. LMSD: LIPID MAPS structure database. Nucleic Acids Research. 35 (Database issue), D527-D532 (2007).
- Pauling, J. K., et al. Proposal for a common nomenclature for fragment ions in mass spectra of lipids. PLoS One. 12 (11), e0188394 (2017).
