Vi presenterer en protokoll ved hjelp av flytende kromatografi kombinert med tandem massespektrometri for å identifisere og kvantifisere store cellulære lipider i Sakkarincerevisiae. Den beskrevne metoden for en kvantitativ vurdering av store lipidklasser i en gjærcelle er allsidig, robust og følsom.
Lipider er strukturelt varierte amhiptaiske molekyler som er uoppløselige i vann. Lipider er viktige bidragsytere til organiseringen og funksjonen til biologiske membraner, energilagring og produksjon, cellulær signalering, vesikulær transport av proteiner, organelle biogenese og regulert celledød. Fordi den spirende gjærSaccharomyces cerevisiae er en encellulær eukaryote mottagelig for grundige molekylære analyser, hjalp bruken som modellorganisme avdekke mekanismer som knytter lipidmetabolisme og intracellulær transport til komplekse biologiske prosesser innen eukaryyotiske celler. Tilgjengeligheten av en allsidig analytisk metode for robust, sensitiv og nøyaktig kvantitativ vurdering av store klasser av lipider i en gjærcelle er avgjørende for å få dyp innsikt i disse mekanismene. Her presenterer vi en protokoll for å bruke flytende kromatografi kombinert med tandem massespektrometri (LC-MS/MS) for kvantitativ analyse av store cellulære lipider av S. cerevisiae. LC-MS/MS-metoden som er beskrevet er allsidig og robust. Det muliggjør identifisering og kvantifisering av mange arter (inkludert forskjellige isobariske eller isomeriske former) i hver av de 10 lipidklassene. Denne metoden er følsom og tillater identifisering og kvantitet av noen lipidarter ved konsentrasjoner så lavt som 0,2 pmol/μL. Metoden har blitt brukt til å vurdere lipidomer av hele gjærceller og deres rensede organeller. Bruken av alternative mobile fase tilsetningsstoffer for elektrospray ionisering massespektrometri i denne metoden kan øke effektiviteten av ionisering for noen lipid arter og kan derfor brukes til å forbedre deres identifikasjon og kvantitet.
En mengde bevis indikerer at lipider, en av de store klassene av biomolekyler, spiller viktige roller i mange viktige prosesser i en eukaryotisk celle. Disse prosessene inkluderer montering av lipidbilag som utgjør plasmamembranen og membranene rundt cellulære organeller, transport av små molekyler på tvers av cellemembraner, respons på endringer i det ekstracellulære miljøet og intracellulær signaltransduksjon, generering og lagring av energi, import og eksport av proteiner begrenset til forskjellige organeller, vesikulær smugling av proteiner i endomembransystemet og proteinsekresjon, og flere moduser regulert celledød1 ,2,3,4,5,6,7,8,9,10.
Den spirende gjær S. cerevisiae, en encellulær eukalær organisme, har blitt brukt til å avdekke noen av mekanismene som ligger til grunn for de essensielle rollene til lipider i disse vitale cellulære prosessene4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 ,16,17,18,19,20. S. cerevisiae er en verdifull modell organisme for å avdekke disse mekanismene fordi det er mottagelig for omfattende biokjemiske, genetiske, celle biologiske, kjemiskbiologiske, system biologiske og mikrofluidiske disseksjonsanalyser21,22,23,24,25. Videre fremgang i å forstå mekanismer der lipidmetabolisme og intracellulær transport bidrar til disse vitale cellulære prosessene krever sensitiv massespektrometriteknologi er for kvantitativ karakterisering av cellulær lipidom, forståelse av lipidommolekylær kompleksitet og integrering av kvantitative lipidomikk i en tverrfaglig plattform av systembiologi1,2,3,26, 27,28,29,30.
Nåværende metoder for massespektrometriassistertkvantitative lipidomics av gjærceller og celler av andre eukaryyotiske organismer er ikke tilstrekkelig allsidige, robuste eller følsomme. Videre er disse brukte metodene i dag ikke i stand til å skille ulike isobariske eller isomeric lipid arter fra hverandre. Her beskriver vi en allsidig, robust og sensitiv metode som tillater bruk av flytende kromatografi kombinert med tandemmassespektrometri (LC-MS/MS) for kvantitativ analyse av store cellulære lipider av S. cerevisiae.
Følgende forholdsregler er viktige for vellykket gjennomføring av protokollen som er beskrevet her:
1. Kloroform og metanol er giftige. De trekker effektivt ut ulike stoffer fra overflater, inkludert laboratorieplasttøy og huden din. Håndter derfor disse organiske løsemidlene med forsiktighet ved å unngå bruk av plast i trinn som involverer kontakt med kloroform og/eller metanol, ved hjelp av borosilikatglasspipetter for disse trinnene, og sner disse pipetter med kloroform og metanol f?…
The authors have nothing to disclose.
Vi er takknemlige til nåværende og tidligere medlemmer av Titorenko-laboratoriet for diskusjoner. Vi anerkjenner Senter for biologiske anvendelser av massespektrometri og Senter for strukturell og funksjonell genomikk (begge ved Concordia University) for fremragende tjenester. Denne studien ble støttet av tilskudd fra Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) i Canada (RGPIN 2014-04482) og Concordia University Chair Fund (CC0113). K.M. ble støttet av Concordia University Merit Award.
15 mL High-speed glass centrifuge tubes with Teflon lined caps | PYREX | 05-550 | |
2 mL Glass sample vials with Teflon lined caps | Fisher Scientific | 60180A-SV9-1P | |
2-Propanol | Fisher Scientific | A461-500 | |
Acetonitrile | Fisher Scientific | A9554 | |
Agilent 1100 series LC system | Agilent Technologies | G1312A | |
Agilent1100 Wellplate | Agilent Technologies | G1367A | |
Ammonium acetate | Fisher Scientific | A11450 | |
Ammonium bicarbonate | Sigma | 9830 | |
Ammonium formate | Fisher Scientific | A11550 | |
Ammonium hydroxide | Fisher Scientific | A470-250 | |
Bactopeptone | Fisher Scientific | BP1420-2 | |
Cardiolipin | Avanti Polar Lipids | 750332 | |
Centra CL2 clinical centrifuge | Thermo Scientific | 004260F | |
Ceramide | Avanti Polar Lipids | 860517 | |
Chloroform | Fisher Scientific | C297-4 | |
CSH C18 VanGuard | Waters | 186006944 | Pre-column system |
Free fatty acid (19:0) | Matreya | 1028 | |
Glass beads (acid-washed, 425-600 μM) | Sigma-Aldrich | G8772 | |
Glucose | Fisher Scientific | D16-10 | |
Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
L-histidine | Sigma | H8125 | |
Lipid Search software (V4.1) | Fisher Scientific | V4.1 | LC-MS/MS analysis software |
L-leucine | Sigma | L8912 | |
L-lysine | Sigma | L5501 | |
Methanol | Fisher Scientific | A4564 | |
Phosphatidylcholine | Avanti Polar Lipids | 850340 | |
Phosphatidylethanolamine | Avanti Polar Lipids | 850704 | |
Phosphatidylglycerol | Avanti Polar Lipids | 840446 | |
Phosphatidylinositol | Avanti Polar Lipids | LM1502 | |
Phosphatidylserine | Avanti Polar Lipids | 840028 | |
Reverse-phase column CSH C18 | Waters | 186006102 | |
Sphingosine | Avanti Polar Lipids | 860669 | |
Thermo Orbitrap Velos MS | Fisher Scientific | ETD-10600 | |
Tricylglycerol | Larodan, Malmo | TAG Mixed FA | |
Ultrasonic sonicator | Fisher Scientific | 15337416 | |
Uracil | Sigma | U0750 | |
Vortex | Fisher Scientific | 2215365 | |
Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-2 | |
Yeast nitrogen base without amino acids | Fisher Scientific | DF0919-15-3 | |
Yeast strain BY4742 | Dharmacon | YSC1049 |