Análise Quantitativa do Lipidome Celular de Saccharomyces Cerevisiae Usando Cromatografia Líquida Juntamente com Espectrometria de Massa de Tandem

Summary

Apresentamos um protocolo utilizando cromatografia líquida juntamente com espectrometria de massa tandem para identificar e quantificar os principais lipídios celulares em Saccharomyces cerevisiae. O método descrito para uma avaliação quantitativa das principais classes lipídicas dentro de uma célula de levedura é versátil, robusto e sensível.

Abstract

Lipídios são moléculas anfípticas estruturalmente diversas que são insolúveis em água. Os lipídios são contribuintes essenciais para a organização e função das membranas biológicas, armazenamento e produção de energia, sinalização celular, transporte vesicular de proteínas, biogênese organela e morte celular regulada. Como a levedura brotante Saccharomyces cerevisiae é um eucariote unicelular passível de análises moleculares completas, seu uso como organismo modelo ajudou a descobrir mecanismos que ligam o metabolismo lipídico e o transporte intracelular a processos biológicos complexos dentro de células eucarióticas. A disponibilidade de um método analítico versátil para a avaliação quantitativa robusta, sensível e precisa das principais classes de lipídios dentro de uma célula de levedura é crucial para obter insights profundos sobre esses mecanismos. Aqui apresentamos um protocolo de utilização de cromatografia líquida juntamente com espectrometria de massa tandem (LC-MS/MS) para a análise quantitativa dos principais lipídios celulares de S. cerevisiae. O método LC-MS/MS descrito é versátil e robusto. Permite a identificação e quantificação de inúmeras espécies (incluindo diferentes formas isóbaras ou isóricas) dentro de cada uma das 10 classes lipídicas. Este método é sensível e permite a identificação e quantitação de algumas espécies lipídicas em concentrações tão baixas quanto 0,2 pmol/μL. O método tem sido aplicado com sucesso na avaliação de lipidomas de células inteiras de levedura e suas organelas purificadas. O uso de aditivos de fase móvel alternativos para espectrometria de massa de ionização eletrospray neste método pode aumentar a eficiência da ionização para algumas espécies lipídicas e, portanto, pode ser usado para melhorar sua identificação e quantitação.

Introduction

Um conjunto de evidências indica que os lipídios, uma das principais classes de biomoléculas, desempenham papéis essenciais em muitos processos vitais dentro de uma célula eucariótica. Esses processos incluem a montagem de bicamadas lipídicas que constituem a membrana plasmática e as membranas ao redor de organelas celulares, o transporte de pequenas moléculas através das membranas celulares, a resposta a alterações no ambiente extracelular e transdução de sinal intracelular, geração e armazenamento de energia, importação e exportação de proteínas confinadas a diferentes organelas, tráfico vesicular de proteínas dentro do sistema de endomembrana e secreção de proteínas, e vários modos de regulação da célula ^{,2,3,4,5,6,7,8,9,10.}

A levedura brotante S. cerevisiae, um organismo eucaótico unicelular, tem sido usada com sucesso para descobrir alguns dos mecanismos subjacentes aos papéis essenciais dos lipídios nestes processos celulares vitais^{4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 ,16,17,18,19,20}. S. cerevisiae é um organismo modelo valioso para a descoberta desses mecanismos, pois é passível de análises abrangentes bioquímicas, genéticas, biológicas, biológicas químicas, biológicas do sistema e microfluidas^{21,22,23,24,25}. Avanços adicionais na compreensão de mecanismos através dos quais o metabolismo lipídico e o transporte intracelular contribuem para esses processos celulares vitais requer tecnologias sensíveis de espectrometria de massa para a caracterização quantitativa do lipidome celular, compreensão da complexidade molecular lipidome e integração de lipidomia quantitativa em uma plataforma multidisciplinar de biologia de sistemas^{1,2,3,26, 27,28,29,30}.

Os métodos atuais para a lipdomia quantitativa assistida por espectrometria de massa de células de levedura e células de outros organismos eucaóticos não são suficientemente versáteis, robustos ou sensíveis. Além disso, esses métodos atualmente utilizados são incapazes de diferenciar várias espécies lipídicas isobarricas ou isóricas umas das outras. Aqui descrevemos um método versátil, robusto e sensível que permite o uso de cromatografia líquida juntamente com espectrometria de massa tandem (LC-MS/MS) para análise quantitativa dos principais lipídios celulares de S. cerevisiae.

Protocol

1. Preparação de mídia estéril para cultivar levedura Prepare 90 mL de um meio YP completo que contenha 1% (c/v) de extrato de levedura e 2% (c/v) bactopepnona. Preparar 90 mL de um meio ynb mínimo sintético contendo 0,67% (c/v) base de nitrogênio de levedura sem aminoácidos, 20 mg/L -histidina, 30 mg/L -leucina, 30 mg/L -lysina e 20 mg/L uracil. Divida 90 mL do meio YP completo igualmente em dois frascos erlenmeyer de 250 mL (ou seja, 45 mL cada). <l…

Representative Results

Nosso método para uma avaliação quantitativa dos principais lipídios celulares dentro de uma célula de levedura com a ajuda de LC-MS/MS foi versátil e robusto. Permitiu identificar e quantificar 10 classes lipídicas diferentes em células s. cerevisiae cultivadas no meio nINS mínimo sintético contendo inicialmente 2% de glicose. Estas classes lipídicas incluem ácidos graxos gratuitos (não esestrdiados) (AFa), CL, fitoceramide (APS), fitosofingosina (PHS), PC, PE, PG, …

Discussion

As seguintes precauções são importantes para a implementação bem sucedida do protocolo descrito aqui:

1. Clorofórmio e metanol são tóxicos. Eles extraem eficientemente várias substâncias de superfícies, incluindo plástico de laboratório e sua pele. Portanto, manuseie esses solventes orgânicos com cautela, evitando o uso de plásticos em etapas que envolvam contato com clorofórmio e/ou metanol, utilizando pipetas de vidro borossilicato para estas etapas, e enxaguando essas pipeta…

Materials

15 mL High-speed glass centrifuge tubes with Teflon lined caps	PYREX	05-550
2 mL Glass sample vials with Teflon lined caps	Fisher Scientific	60180A-SV9-1P
2-Propanol	Fisher Scientific	A461-500
Acetonitrile	Fisher Scientific	A9554
Agilent 1100 series LC system	Agilent Technologies	G1312A
Agilent1100 Wellplate	Agilent Technologies	G1367A
Ammonium acetate	Fisher Scientific	A11450
Ammonium bicarbonate	Sigma	9830
Ammonium formate	Fisher Scientific	A11550
Ammonium hydroxide	Fisher Scientific	A470-250
Bactopeptone	Fisher Scientific	BP1420-2
Cardiolipin	Avanti Polar Lipids	750332
Centra CL2 clinical centrifuge	Thermo Scientific	004260F
Ceramide	Avanti Polar Lipids	860517
Chloroform	Fisher Scientific	C297-4
CSH C18 VanGuard	Waters	186006944	Pre-column system
Free fatty acid (19:0)	Matreya	1028
Glass beads (acid-washed, 425-600 μM)	Sigma-Aldrich	G8772
Glucose	Fisher Scientific	D16-10
Hemacytometer	Fisher Scientific	267110
L-histidine	Sigma	H8125
Lipid Search software (V4.1)	Fisher Scientific	V4.1	LC-MS/MS analysis software
L-leucine	Sigma	L8912
L-lysine	Sigma	L5501
Methanol	Fisher Scientific	A4564
Phosphatidylcholine	Avanti Polar Lipids	850340
Phosphatidylethanolamine	Avanti Polar Lipids	850704
Phosphatidylglycerol	Avanti Polar Lipids	840446
Phosphatidylinositol	Avanti Polar Lipids	LM1502
Phosphatidylserine	Avanti Polar Lipids	840028
Reverse-phase column CSH C18	Waters	186006102
Sphingosine	Avanti Polar Lipids	860669
Thermo Orbitrap Velos MS	Fisher Scientific	ETD-10600
Tricylglycerol	Larodan, Malmo	TAG Mixed FA
Ultrasonic sonicator	Fisher Scientific	15337416
Uracil	Sigma	U0750
Vortex	Fisher Scientific	2215365
Yeast extract	Fisher Scientific	BP1422-2
Yeast nitrogen base without amino acids	Fisher Scientific	DF0919-15-3
Yeast strain BY4742	Dharmacon	YSC1049