Análisis cuantitativo del lipidomo celular de Saccharomyces Cerevisiae utilizando cromatografía líquida junto con espectrometría de masas en tándem
Summary
Presentamos un protocolo que utiliza cromatografía líquida junto con espectrometría de masas en tándem para identificar y cuantificar los principales lípidos celulares en Saccharomyces cerevisiae. El método descrito para una evaluación cuantitativa de las principales clases de lípidos dentro de una célula de levadura es versátil, robusto y sensible.
Abstract
Los lípidos son moléculas anfipáticas estructuralmente diversas que son insolubles en agua. Los lípidos son factores esenciales que contribuyen a la organización y función de las membranas biológicas, el almacenamiento y la producción de energía, la señalización celular, el transporte vesicular de proteínas, la biogénesis de los orgánulos y la muerte celular regulada. Debido a que la levadura en ciernes Saccharomyces cerevisiae es un eucariota unicelular susceptible de análisis moleculares exhaustivos, su uso como organismo modelo ayudó a descubrir mecanismos que vinculaban el metabolismo lipídico y el transporte intracelular a procesos biológicos complejos dentro de las células eucariotas. La disponibilidad de un método analítico versátil para la evaluación cuantitativa robusta, sensible y precisa de las principales clases de lípidos dentro de una célula de levadura es crucial para obtener información profunda sobre estos mecanismos. Aquí presentamos un protocolo para utilizar cromatografía líquida junto con espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) para el análisis cuantitativo de los principales lípidos celulares de S. cerevisiae. El método LC-MS/MS descrito es versátil y robusto. Permite la identificación y cuantificación de numerosas especies (incluyendo diferentes formas isobáricas o isoméricas) dentro de cada una de las 10 clases de lípidos. Este método es sensible y permite la identificación y cuantificación de algunas especies de lípidos a concentraciones tan bajas como 0,2 pmol/L. El método se ha aplicado con éxito para evaluar los lípidos de las células enteras de la levadura y sus orgánulos purificados. El uso de aditivos alternativos de fase móvil para la espectrometría de masas de ionización por electrospray en este método puede aumentar la eficiencia de la ionización para algunas especies de lípidos y, por lo tanto, puede utilizarse para mejorar su identificación y cuantificación.
Introduction
Un conjunto de evidencia indica que los lípidos, una de las principales clases de biomoléculas, desempeñan un papel esencial en muchos procesos vitales dentro de una célula eucariota. Estos procesos incluyen el montaje de bicapas lipídicas que constituyen la membrana plasmática y las membranas que rodean los orgánulos celulares, el transporte de pequeñas moléculas a través de las membranas celulares, la respuesta a los cambios en el entorno extracelular y la transducción de señales intracelulares, generación y almacenamiento de energía, importación y exportación de proteínas confinadas a diferentes orgánulos, tráfico vesicular de proteínas dentro del sistema de endomembrana y proteína de secreción, y varios modos de muerte celular regulada1 ,2,3,4,5,6,7,8,9,10.
La levadura en ciernes S. cerevisiae, un organismo eucariota unicelular, se ha utilizado con éxito para descubrir algunos de los mecanismos subyacentes a las funciones esenciales de los lípidos en estos procesos celulares vitales4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 ,16,17,18,19,20. S. cerevisiae es un valioso organismo modelo para descubrir estos mecanismos porque es susceptible a análisis integrales bioquímicos, genéticos, biológicos celulares, biológicos químicos, biológicos del sistema y microfluídicos21,22,23,24,25. Un mayor progreso en la comprensión de los mecanismos a través de los cuales el metabolismo lipídico y el transporte intracelular contribuyen a estos procesos celulares vitales requiere tecnologías sensibles de espectrometría de masas para la caracterización cuantitativa del lipidoma, la comprensión de la complejidad molecular del lípido, e integrando la lipidómica cuantitativa en una plataforma multidisciplinaria de biología de sistemas1,2,3,26, 27,28,29,30.
Los métodos actuales para la lipidómica cuantitativa asistida por espectrometría de masas de las células de levadura y las células de otros organismos eucariotas no son lo suficientemente versátiles, robustos o sensibles. Además, estos métodos utilizados actualmente son incapaces de diferenciar varias especies de lípidos isobáricos o isoméricos entre sí. Aquí describimos un método versátil, robusto y sensible que permite el uso de cromatografía líquida junto con espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) para el análisis cuantitativo de los principales lípidos celulares de S. cerevisiae.
Protocol
Representative Results
Discussion
Las siguientes precauciones son importantes para la implementación exitosa del protocolo descrito aquí:
1. El cloroformo y el metanol son tóxicos. Extraen eficientemente diversas sustancias de las superficies, incluyendo plásticos de laboratorio y su piel. Por lo tanto, manipule estos disolventes orgánicos con precaución evitando el uso de plásticos en pasos que impliquen contacto con cloroformo y/o metanol, utilizando pipetas de vidrio borosilicato para estos pasos, y enhebando estas p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a los miembros actuales y anteriores del laboratorio Titorenko los debates. Reconocemos el Centro de Aplicaciones Biológicas de la Espectrometría de Masas y el Centro de Genómica Estructural y Funcional (ambos en la Universidad de Concordia) por sus servicios sobresalientes. Este estudio fue apoyado por subvenciones del Consejo de Investigación en Ciencias Naturales e Ingeniería (NSERC) de Canadá (RGPIN 2014-04482) y del Fondo de Cátedras de la Universidad de Concordia (CC0113). K.M. fue apoyado por el Premio al Mérito de la Universidad de Concordia.
Materials
| 15 mL High-speed glass centrifuge tubes with Teflon lined caps | PYREX | 05-550 | |
| 2 mL Glass sample vials with Teflon lined caps | Fisher Scientific | 60180A-SV9-1P | |
| 2-Propanol | Fisher Scientific | A461-500 | |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | A9554 | |
| Agilent 1100 series LC system | Agilent Technologies | G1312A | |
| Agilent1100 Wellplate | Agilent Technologies | G1367A | |
| Ammonium acetate | Fisher Scientific | A11450 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma | 9830 | |
| Ammonium formate | Fisher Scientific | A11550 | |
| Ammonium hydroxide | Fisher Scientific | A470-250 | |
| Bactopeptone | Fisher Scientific | BP1420-2 | |
| Cardiolipin | Avanti Polar Lipids | 750332 | |
| Centra CL2 clinical centrifuge | Thermo Scientific | 004260F | |
| Ceramide | Avanti Polar Lipids | 860517 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | C297-4 | |
| CSH C18 VanGuard | Waters | 186006944 | Pre-column system |
| Free fatty acid (19:0) | Matreya | 1028 | |
| Glass beads (acid-washed, 425-600 μM) | Sigma-Aldrich | G8772 | |
| Glucose | Fisher Scientific | D16-10 | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| L-histidine | Sigma | H8125 | |
| Lipid Search software (V4.1) | Fisher Scientific | V4.1 | LC-MS/MS analysis software |
| L-leucine | Sigma | L8912 | |
| L-lysine | Sigma | L5501 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A4564 | |
| Phosphatidylcholine | Avanti Polar Lipids | 850340 | |
| Phosphatidylethanolamine | Avanti Polar Lipids | 850704 | |
| Phosphatidylglycerol | Avanti Polar Lipids | 840446 | |
| Phosphatidylinositol | Avanti Polar Lipids | LM1502 | |
| Phosphatidylserine | Avanti Polar Lipids | 840028 | |
| Reverse-phase column CSH C18 | Waters | 186006102 | |
| Sphingosine | Avanti Polar Lipids | 860669 | |
| Thermo Orbitrap Velos MS | Fisher Scientific | ETD-10600 | |
| Tricylglycerol | Larodan, Malmo | TAG Mixed FA | |
| Ultrasonic sonicator | Fisher Scientific | 15337416 | |
| Uracil | Sigma | U0750 | |
| Vortex | Fisher Scientific | 2215365 | |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-2 | |
| Yeast nitrogen base without amino acids | Fisher Scientific | DF0919-15-3 | |
| Yeast strain BY4742 | Dharmacon | YSC1049 |
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