Kvantitativ analys av cellulär lipidom e av Saccharomyces Cerevisiae med hjälp av flytande kromatografi tillsammans med Tandem Mass Spectrometri
Summary
Vi presenterar ett protokoll med flytande kromatografi tillsammans med tandem massa spektrometri för att identifiera och kvantifiera stora cellulära lipider i Saccharomyces cerevisiae. Den beskrivna metoden för en kvantitativ bedömning av större lipidklasser i en jästcell är mångsidig, robust och känslig.
Abstract
Lipider är strukturellt olika amfipatiska molekyler som är olösliga i vatten. Lipider är viktiga bidragsgivare till organisationen och funktionen av biologiska membran, energilagring och produktion, cellulär signalering, fordonstransport av proteiner, organelle biogenes och reglerad celldöd. Eftersom den spirande jästen Saccharomyces cerevisiae är en encellig eukaryote mottaglig för grundliga molekylära analyser, hjälpte dess användning som modellorganism till att avslöja mekanismer som kopplar lipidmetabolism och intracellulära transporter till komplexa biologiska processer inom eukaryota celler. Tillgången till en mångsidig analysmetod för robust, känslig och korrekt kvantitativ bedömning av större klasser av lipider i en jästcell är avgörande för att få djupa insikter i dessa mekanismer. Här presenterar vi ett protokoll för att använda flytande kromatografi tillsammans med tandem masspektrometri (LC-MS/MS) för kvantitativ analys av större cellulära lipider av S. cerevisiae. LC-MS/MS-metoden som beskrivs är mångsidig och robust. Det möjliggör identifiering och kvantifiering av många arter (inklusive olika isobariska eller isomeric former) inom var och en av de 10 lipidklasser. Denna metod är känslig och möjliggör identifiering och kvantiering av vissa lipidarter vid koncentrationer så låga som 0,2 pmol/μL. Metoden har framgångsrikt tillämpats på att bedöma lipidomer av hela jästceller och deras renade organeller. Användningen av alternativa mobila fastillsatser för elektrosprayjonisering massa spektrometri i denna metod kan öka effektiviteten i jonisering för vissa lipidarter och kan därför användas för att förbättra deras identifiering och kvantisering.
Introduction
En mängd bevis tyder på att lipider, en av de viktigaste klasserna av biomolekyler, spelar viktiga roller i många viktiga processer inom en eukaryota cell. Dessa processer omfattar montering av lipidbilayers som utgör plasmamembran och membran kring cellulära organeller, transport av små molekyler över cellmembran, svar på förändringar i den extracellulära miljön och intracellulära signaltransduktion, generering och lagring av energi, import och export av proteiner som är begränsade till olika organeller, fordonshandel med proteiner inom endomembranesystemet och proteinutsöndringen samt flera sätt att reglera disponikeldöd1 ,2,3,4,5,6,7,8,9,10.
Den spirande jäst S. cerevisiae, en encellig eukaryota organism, har framgångsrikt använts för att avslöja några av de mekanismer som ligger till grund för de väsentliga rollerna av lipider i dessa viktiga cellulära processer4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 ,16,17,18,19,20. S. cerevisiae är en värdefull modell organism för att avslöja dessa mekanismer eftersom det är mottagliga för omfattande biokemiska, genetiska, cell biologiska, kemiska biologiska, system biologiska, och mikrofluidiska dissekering analyser21,22,23,24,25. Ytterligare framsteg i förståelse mekanismer genom vilka lipidmetabolism och intracellulära transporter bidrar till dessa viktiga cellulära processer kräver känsliga massa spectrometri teknik för kvantitativ karakterisering av cellulära lipidom, förstå lipidom molekylär komplexitet, och integrera kvantitativa lipidomik i en tvärvetenskaplig plattform av systembiologi1,2,3,26, 27,28,29,30.
Nuvarande metoder för masspektrometriassisterad kvantitativa lipidomik av jästceller och celler i andra eukaryota organismer är inte tillräckligt mångsidiga, robusta eller känsliga. Dessutom är dessa metoder som för närvarande används inte kan skilja olika isobariska eller isomeric lipidarter från varandra. Här beskriver vi en mångsidig, robust och känslig metod som tillåter användning av flytande kromatografi tillsammans med tandem masspektrometri (LC-MS/MS) för kvantitativ analys av större cellulära lipider av S. cerevisiae.
Protocol
Representative Results
Discussion
Följande försiktighetsåtgärder är viktiga för ett framgångsrikt genomförande av det protokoll som beskrivs här:
1. Kloroform och metanol är giftiga. De extraherar effektivt olika ämnen från ytor, inklusive laboratorieplastoch din hud. Därför hantera dessa organiska lösningsmedel med försiktighet genom att undvika användning av plast i steg som innebär kontakt med kloroform och / eller metanol, med borosilikat glas pipetter för dessa steg, och skölja dessa pipetter med kloro…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi är tacksamma mot nuvarande och tidigare medlemmar av Titorenkolaboratoriet för diskussioner. Vi erkänner Centrum för biologiska tillämpningar av masspektrometri och Centrum för strukturell och funktionell genomik (båda vid Concordia University) för enastående tjänster. Studien stöddes av bidrag från Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) of Canada (RGPIN 2014-04482) och Concordia University Chair Fund (CC0113). K.M. stöddes av Concordia University Merit Award.
Materials
| 15 mL High-speed glass centrifuge tubes with Teflon lined caps | PYREX | 05-550 | |
| 2 mL Glass sample vials with Teflon lined caps | Fisher Scientific | 60180A-SV9-1P | |
| 2-Propanol | Fisher Scientific | A461-500 | |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | A9554 | |
| Agilent 1100 series LC system | Agilent Technologies | G1312A | |
| Agilent1100 Wellplate | Agilent Technologies | G1367A | |
| Ammonium acetate | Fisher Scientific | A11450 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma | 9830 | |
| Ammonium formate | Fisher Scientific | A11550 | |
| Ammonium hydroxide | Fisher Scientific | A470-250 | |
| Bactopeptone | Fisher Scientific | BP1420-2 | |
| Cardiolipin | Avanti Polar Lipids | 750332 | |
| Centra CL2 clinical centrifuge | Thermo Scientific | 004260F | |
| Ceramide | Avanti Polar Lipids | 860517 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | C297-4 | |
| CSH C18 VanGuard | Waters | 186006944 | Pre-column system |
| Free fatty acid (19:0) | Matreya | 1028 | |
| Glass beads (acid-washed, 425-600 μM) | Sigma-Aldrich | G8772 | |
| Glucose | Fisher Scientific | D16-10 | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| L-histidine | Sigma | H8125 | |
| Lipid Search software (V4.1) | Fisher Scientific | V4.1 | LC-MS/MS analysis software |
| L-leucine | Sigma | L8912 | |
| L-lysine | Sigma | L5501 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A4564 | |
| Phosphatidylcholine | Avanti Polar Lipids | 850340 | |
| Phosphatidylethanolamine | Avanti Polar Lipids | 850704 | |
| Phosphatidylglycerol | Avanti Polar Lipids | 840446 | |
| Phosphatidylinositol | Avanti Polar Lipids | LM1502 | |
| Phosphatidylserine | Avanti Polar Lipids | 840028 | |
| Reverse-phase column CSH C18 | Waters | 186006102 | |
| Sphingosine | Avanti Polar Lipids | 860669 | |
| Thermo Orbitrap Velos MS | Fisher Scientific | ETD-10600 | |
| Tricylglycerol | Larodan, Malmo | TAG Mixed FA | |
| Ultrasonic sonicator | Fisher Scientific | 15337416 | |
| Uracil | Sigma | U0750 | |
| Vortex | Fisher Scientific | 2215365 | |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-2 | |
| Yeast nitrogen base without amino acids | Fisher Scientific | DF0919-15-3 | |
| Yeast strain BY4742 | Dharmacon | YSC1049 |
References
- Bou Khalil, M., et al. Lipidomics era: accomplishments and challenges. Mass Spectrometry Review. 29 (6), 877-929 (2010).
- Shevchenko, A., Simons, K. Lipidomics: coming to grips with lipid diversity. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (8), 593-598 (2010).
- Brügger, B. Lipidomics: analysis of the lipid composition of cells and subcellular organelles by electrospray ionization mass spectrometry. Annual Review of Biochemistry. 83, 79-98 (2014).
- Zechner, R., et al. FAT SIGNALS – lipases and lipolysis in lipid metabolism and signaling. Cell Metabolism. 15 (3), 279-291 (2012).
- Eisenberg, T., Büttner, S. Lipids and cell death in yeast. FEMS Yeast Research. 14 (1), 179-197 (2014).
- Richard, V. R., et al. Mechanism of liponecrosis, a distinct mode of programmed cell death. Cell Cycle. 13 (23), 3707-3726 (2014).
- Arlia-Ciommo, A., Svistkova, V., Mohtashami, S., Titorenko, V. I. A novel approach to the discovery of anti-tumor pharmaceuticals: searching for activators of liponecrosis. Oncotarget. 7 (5), 5204-5225 (2016).
- Mårtensson, C. U., Doan, K. N., Becker, T. Effects of lipids on mitochondrial functions. Biochimica et Biophysica Acta. 1862 (1), 102-113 (2017).
- Basu Ball, W., Neff, J. K., Gohil, V. M. The role of non-bilayer phospholipids in mitochondrial structure and function. FEBS Letters. 592 (8), 1273-1290 (2018).
- Thakur, R., Naik, A., Panda, A., Raghu, P. Regulation of membrane turnover by phosphatidic acid: cellular functions and disease implications. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 83 (2019).
- Goldberg, A. A., et al. A novel function of lipid droplets in regulating longevity. Biochemical Society Transactions. 37 (5), 1050-1055 (2009).
- Kohlwein, S. D. Obese and anorexic yeasts: experimental models to understand the metabolic syndrome and lipotoxicity. Biochimica et Biophysica Acta. 1801 (3), 222-229 (2010).
- Titorenko, V. I., Terlecky, S. R. Peroxisome metabolism and cellular aging. Traffic. 12 (3), 252-259 (2011).
- Henry, S. A., Kohlwein, S. D., Carman, G. M. Metabolism and regulation of glycerolipids in the yeast Saccharomyces cerevisiae. 유전학. 190 (2), 317-349 (2012).
- Kohlwein, S. D., Veenhuis, M., vander Klei, I. J. Lipid droplets and peroxisomes: key players in cellular lipid homeostasis or a matter of fat–store ’em up or burn ’em down. 유전학. 193 (1), 1-50 (2013).
- Baile, M. G., Lu, Y. W., Claypool, S. M. The topology and regulation of cardiolipin biosynthesis and remodeling in yeast. Chemistry and Physics of Lipids. 179, 25-31 (2014).
- Dimmer, K. S., Rapaport, D. Mitochondrial contact sites as platforms for phospholipid exchange. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (1), 69-80 (2017).
- Csordás, G., Weaver, D., Hajnóczky, G. Endoplasmic reticulum-mitochondrial contactology: structure and signaling functions. Trends in Cell Biology. 28 (7), 523-540 (2018).
- Mitrofanova, D., et al. Lipid metabolism and transport define longevity of the yeast Saccharomyces cerevisiae. Frontiers in Bioscience (Landmark Edition). 23, 1166-1194 (2018).
- Tamura, Y., Kawano, S., Endo, T. Organelle contact zones as sites for lipid transfer. Journal of Biochemistry. 165 (2), 115-123 (2019).
- Weissman, J., Guthrie, C., Fink, G. R. . Guide to Yeast Genetics: Functional Genomics, Proteomics, and Other Systems Analyses. , (2010).
- Botstein, D., Fink, G. R. Yeast: an experimental organism for 21st Century biology. 유전학. 189 (3), 695-704 (2011).
- Duina, A. A., Miller, M. E., Keeney, J. B. Budding yeast for budding geneticists: a primer on the Saccharomyces cerevisiae model system. 유전학. 197 (1), 33-48 (2014).
- Strynatka, K. A., Gurrola-Gal, M. C., Berman, J. N., McMaster, C. R. How surrogate and chemical genetics in model organisms can suggest therapies for human genetic diseases. 유전학. 208 (3), 833-851 (2018).
- Zimmermann, A., et al. Yeast as a tool to identify anti-aging compounds. FEMS Yeast Research. 18 (6), (2018).
- Ejsing, C. S., et al. Global analysis of the yeast lipidome by quantitative shotgun mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (7), 2136-2141 (2009).
- Guan, X. L., Riezman, I., Wenk, M. R., Riezman, H. Yeast lipid analysis and quantification by mass spectrometry. Methods in Enzymology. 470, 369-391 (2010).
- Guan, X. L., et al. Biochemical membrane lipidomics during Drosophila development. Developmental Cell. 24 (1), 98-111 (2013).
- Klose, C., Tarasov, K. Profiling of yeast lipids by shotgun lipidomics. Methods in Molecular Biology. 1361, 309-324 (2016).
- Wang, M., Wang, C., Han, R. H., Han, X. Novel advances in shotgun lipidomics for biology and medicine. Progress in Lipid Research. 61, 83-108 (2016).
- Sud, M., et al. LMSD: LIPID MAPS structure database. Nucleic Acids Research. 35 (Database issue), D527-D532 (2007).
- Pauling, J. K., et al. Proposal for a common nomenclature for fragment ions in mass spectra of lipids. PLoS One. 12 (11), e0188394 (2017).
