Этот протокол описывает хирургическое поколение ортотопических опухолей поджелудочной железы и быстрое переваривание свежеизолированных опухолей поджелудочной железы. После пищеварения, жизнеспособные популяции иммунных клеток могут быть использованы для дальнейшего анализа вниз по течению, в том числе ex vivo стимуляции Т-клеток для внутриклеточного обнаружения цитокинов с помощью цитометрии потока.
In vivo модели рака поджелудочной железы предоставляют бесценные инструменты для изучения динамики заболеваний, иммунной инфильтрации и новых терапевтических стратегий. Ортотопическая моуринная модель может быть выполнена на больших когортах иммунокомпетентных мышей одновременно, является относительно недорогой и сохраняет коньяк ткани микроокружения. Количественная оценка инфильтрации Т-клеток и цитотоксическая активность в ортотопических опухолях является полезным показателем противоопухолевого ответа.
Этот протокол описывает методологию хирургического поколения ортотопических опухолей поджелудочной железы путем инъекций низкого числа сингенных опухолевых клеток, перевезненных в мембране подвала 5 Л непосредственно в поджелудочную железу. Мыши подшипник ортотопических опухолей занять около 30 дней, чтобы достичь конечной точки, в этот момент опухоли могут быть собраны и обработаны для характеристики опухоли инфильтрации Т-клеток деятельности. Быстрое ферментативное пищеварение с помощью коллагеназы и DNase позволяет извлекать одноклеточную суспензию из опухолей. Сохраняется жизнеспособность и маркеры поверхности клеток иммунных клеток, извлеченных из опухоли; Поэтому, это подходит для нескольких приложений вниз по течению, в том числе поток-помощь клеток сортировки иммунных клеток для культуры или экстракции РНК, циклометрический анализ потока иммунных клеток населения. Здесь мы описываем ex vivo стимуляцию популяций Т-клеток для внутриклеточной количественной оценки цитокинов (IFN и TNF) и дегранизационной активности (CD107a) как меру общей цитотоксичности. Цельноопухолевые дайджесты стимулировались ацетатом phorbol myristate и иомамицином на 5 ч, в присутствии анти-CD107a антитела для того, чтобы upregulate производства цитокинов и дегранизывания. Добавление брефельдина А и монэнсина для финальных 4 ч было выполнено для блокирования внеклеточного транспорта и максимального обнаружения цитокинов. Вне- и внутриклеточного окрашивания клеток затем было выполнено для анализа цитометрии потока, где пропорция IFN,TNFи CD107a– CD4 и CD8– Т-клеток была количественно.
Этот метод обеспечивает стартовую основу для проведения всестороннего анализа микросреды опухоли.
Этот метод детали, от начала до конца, хирургическая процедура для генерации ортотопических опухолей поджелудочной железы с использованием минимального количества клеточного материала и последующей быстрой диссоциации установленных опухолей для всеобъемлющего анализа цитометрии потока иммунных клеток населения, в том числе ex vivo анализ функции Т-клеток.
Аденокарцинома поджелудочной железы (PDAC) является агрессивной карциномой, при этом только 8% пациентов выживают 5 лет1. Поскольку менее 20% пациентов имеют право на хирургическую резекцию2, свежие образцы пациентов не легко доступны для исследований и, таким образом, модели in vivo предоставляют необходимые инструменты для исследования этого заболевания. Есть несколько моделей murine PDAC: ортотопические, подкожные, трансгенные, внутривенные и пациент-производные ксенотрансплантат (PDX), широко описаны здесь3. Описанная здесь ортотопическая модель позволяет впрыснуть сингенные клетки PDAC в поджелудочную железу иммунокомпетентных мышей. Это может быть выполнено в больших когортах диких или мутантных мышей, и, таким образом, обеспечивает экономически эффективную и последовательную модель для сравнения терапевтических агентов. Важно отметить, что ортотопическая модель обеспечивает cognate микроокружения для роста опухолевых клеток и метастазирует в наших руках и других4 к клинически значимым местам (например, печени), что делает его более клинически актуальным, чем подкожные или химически индуцированных моделей. Ортотопические опухоли отображают ключевые особенности PDAC, такие как сильная десмопластическая реакция с обилием фибробластов и внеклеточным ивкообразимым матричным осаждением5. Трансгенные модели PDAC являются золотым стандартом модели мурина и наиболее часто используется модель KPC, которая выражает мутант КрасG12D / и Trp53R172H / “ под поджелудочной железы конкретных Pdx-1-Cre промоутер6. Дополнительные модели KPC и других in vivo PDAC рассматриваются здесь7. Мыши КЗК спонтанно развивают опухоли поджелудочной железы с прогрессированием заболевания, которое точно повторяет особенности человека PDAC6. Однако, как и для всех трансгенных моделей, программа разведения является дорогостоящим, прогрессирование опухоли является переменной и, следовательно, часто требует больших когорт мышей. Модели PDX используют опухолевые клетки или кусочки, полученные от пациента, которые затем выращиваются либо ортотопически, либо чаще подкожно у мышей с ослабленным иммунитетом. Модели Xenograft предоставляют полезные инструменты для скрининга терапевтических соединений и учитывают неоднородность пациента. Тем не менее, они не обеспечивают полной иммунной микросреды, тем самым ограничивая их применения8,9.
После установления, ортотопические опухоли обычно занимают около 1 месяца или более, чтобы расти (в зависимости от клеточной линии используется) и образуют большие опухоли, которые могут быть легко изображения с помощью ультразвука или МРТ для отслеживания прогрессирования и определить эффективность лечения4,5,10. Однако, как только в экспоненциальном росте, последняя фаза роста опухоли может быть быстрой, поэтому большинство схем лечения начинаются относительно рано (например, 14 дней)11,12. Иммунная система играет важную роль в развитии опухоли, в том числе в PDAC, которая характеризуется иммуносупрессивной опухоль проникает с относительной нехваткой Т-клеток и частым присутствием миелоидных клеток13. Высокое присутствие Т-клеток в PDAC дает лучший прогноз14,15. Однако, как одиночные агенты, ингибиторы иммунной контрольной точки, которые снимают иммуносупрессию Т-клеток, такие как анти-CTLA-416 и анти-PD-L117, не показали клинической пользы у пациентов PDAC, скорее всего, потому что общая реактивность Т-клеток очень низка. Тем не менее, агенты, которые премьер Т-клеток ответов, таких как анти-CD40, может преодолеть анти-PD-L11/CTLA-4 сопротивление18,19 и вакцинация с ГМ-CSF-секретирования аллогенной вакцины PDAC (GVAX) может увеличить иммуногенность опухолей PDAC20, что свидетельствует о том, что повышение Реакции Т-клеток формирует важный терапевтический путь.
Критически важным для противоопухолевого Ответа Т-клеток является распознавание антигенов, полученных из опухоли, через Т-клеточный рецептор (ТКР) и последующее производство цитотоксических цитокинов и гранул. В то время как распознавание Т-клеток может быть определено путем секвенирования TCR, этот подход является дорогостоящим и трудоемким. Тем не менее, количественная оценка инфильтрации опухолей Т-клеток подмножества обеспечивает хорошее указание на противоопухолевую реакцию. Дальнейшее изучение активности Т-клеток ex vivo с точки зрения дегранизации, производства цитокинов и других цитотоксических факторов обеспечивает более глубокий функциональный анализ. Эти анализы могут быть выполнены на свежих образцов опухоли и многие параметры функции Т-клеток могут быть измерены быстро поток цитометрии.
CD8 и CD4– Т-клетки производят цитокины, такие как IFN и TNF, чтобы потенцировать иммунный ответ21. ИФНЗ индуцирует MHCI upregulation на клетках-мишенях, индуцирует дифференциацию и вербовку иммунных клеток и способствует смерти клеток. Производство ИФНЗ по CD8и Т-клеткам хорошо характеризуется как часть противоопухолевого ответа и коррелирует с регрессией опухоли22,23. ТНФЗ является еще одним провоспалительным цитокином, производимым какCD8, так и CD4и Т-клетками. Это усиливает TCR-зависимой активации и пролиферации Т-клеток, помогая противоопухолевой реакции. После участия TCR, цитотоксические CD8и Т-клетки могут пройти дегранизацию, где предварительно сформированные секреторные лиизосомы, содержащие цитотоксические молекулы, высвобождаются в иммунологический синапс, чтобы вызвать деградацию целевых клеток21. Эти молекулы включают Перфорин, белок, который связывается с мембраной клетки-мибры, образуя поры, которые затем нарушают целостность мембраны и позволяют диффузии21 или эндоцитоз24 других цитотоксических молекул, таких как Granzyme B, непосредственно в цитоплазму клетки-мишени. Granzyme B является протеаза, которая принимает деградации нескольких белков в клетке-мишени, что приводит к гибели клеток21. Освобождение таких молекул требует экзоцитоза эндосом на поверхность клетки, где эндосомный маркер CD107a (также известный как LAMP-1) временно включен в клеточной мембране25.
Измерение секреции цитокинов Т-клетками требует их изоляции либо путем сортировки клеток, либо анализов разделения на основе биса, которые не могут быть легко выполнены на большом количестве образцов одновременно. Однако измерение внутриклеточных цитокинов не требует каких-либо предизоляционных шагов и может быть легко выполнено на нескольких образцах одновременно, что позволяет более высокой пропускной связи. Поскольку цитокины быстро выделяются Т-клетками, внутриклеточные уровни могут быть необнаружимы, и, таким образом, Т-клетка требует стимуляции для увеличения производства базального цитокина. Для оценки производства цитокинов, управляемых антигеном, антиген, признанный TCR, должен быть представлен Т-клетке загрунтованным APC in vitro. В тех случаях, когда специфика антигена неизвестна, необходим широкий подход к стимуляции. Стимуляция TCR может быть имитирована с помощью анти-CD3/28 бусин, которые обеспечивают как активацию TCR и костимуляцию, которая вызывает производство цитокинов и пролиферации. Однако более экономичной альтернативой является использование ПМА и иомицина, которые вместе широко активируют сигнальные пути, которые приводят к синтезу и высвобождению внутриклеточных цитокинов. В частности, PMA активирует протеиновый киназа C (PKC) и иономицин повышает внутриклеточные ионы Ca2, что приводит к увеличению сигнализации клеток. Для сохранения внутриклеточного содержания цитокинов эта стимуляция может эффективно сочетаться с белково-транспортными ингибиторами брефельдина А и монэнсина, которые блокируют белки в голги и тем самым предотвращают внеклеточное высвобождение. Использование PMA/ionomycin является устоявшимся методом стимулирования Т-клеток и существует сильная корреляция между внеклеточными и внутриклеточными цитокинов26. Стимулирование Т-клеток с PmA и иомамицинтакже также увеличивает оборот лизосомы к клеточной мембране и, таким образом, CD107a становится переходно интегрированной на поверхности клетки перед переработкой в клетку. Включая анти-CD107a антитела во время стимуляции, можно использовать его в качестве маркера дегрануляции деятельности25.
Этот метод быстро переваривает опухоли, чтобы обеспечить одноклеточную суспензию. На данный момент отдельные популяции могут быть непосредственно окрашены для цитометрии потока или очищены методами вниз по течению: сортировкой клеток при помощи потока или разделением магнитно-биса. Приготовление одноклеточной суспензии для анализа цитометрии потока позволяет высокопрокладочный анализ нескольких популяций иммунных клеток и их фенотипических маркеров, обеспечивая точную количественную оценку числа иммунных клеток и фенотипа.
Наконец, описанный здесь протокол пищеварения предотвращает потерю маркеров клеточной поверхности и поддерживает жизнеспособность иммунных клеток, позволяя иммунным клеткам пройти дальнейшие шаги по очистке клеток и культуру по мере необходимости. Однако, этот метод не был протестирован для получения эпителиальных клеток из этого пищеварения.
В vivo модели рака поджелудочной железы обеспечивают бесценные инструменты для понимания прогрессирования заболевания и оценки новых терапевтических целей3. Ортотопическая модель, вчастности,является экономически эффективной и воспроизводимой моделью, которая может быть применена в больших когортах мышей одновременно4,27. Ортотопическая модель также обеспечивает cognate микроокружения и нетронутой иммунной системы для роста опухоли, что делает его более подходящим, чем подкожные и PDX-модели. Тем не менее, мы обнаружили, что некоторые элементы иммунной инфильтрации могут отличаться между ортотопической модели и КЗК мышей, золотостандартный мурин модель10. Одной из причин этого может быть ускоренный рост опухоли видели в ортотопической модели. Дальнейшие различия в плотности подмножеств иммунных клеток были описаны между ортотопическими и подкожными моделями3,28. Поэтому, хотя трансгенная модель КЗК является более дорогостоящей и переменной6,ключевые выводы должны быть проверены в небольшой когорте мышей КЗК, где это возможно.
Подготовка опухолевых клеток к ортотопической хирургии является критическим шагом в протоколе. Клетки всегда должны быть в бревенчатой фазе роста и микоплазмы и инфекции. Ортотопическая хирургия должна быть отложена, если есть какие-либо опасения по поводу роста опухолевых клеток. Использование подвальной мембраны улучшает частоту заболеваемости опухоли по сравнению с инъекционными клетками без него29 и уменьшает утечку клеток и, таким образом, перитонеальный спред27. Однако, после подвешенной в подвале мембраны, опухолевые клетки должны быть быстро введены (в течение 2 часов), чтобы избежать потери клеток. Количество опухолевых клеток, необходимых для генерации опухолей, вероятно, будет клеточной линии зависит, и ряд клеточных чисел должны быть проверены (например, от 100 до 100000), которые также могут определить время для достижения конечной точки. Вполне вероятно, что будет погрешность при подготовке 1000 клеток на мышь для инъекции; поэтому, если требуется несколько дней операции, лечение групп должно быть равномерно распределено в течение нескольких дней для контроля за пакетными эффектами. Большинство хирургических шагов могут быть изменены в зависимости от предпочтений; однако необходимо позаботиться о том, чтобы не нарушать мембрану подвала при замене поджелудочной железы в брюшной полости или закрытии брюшной стенки. Утечка мембраны подвала может вызвать рост опухолевых клеток на перитонеальной стенке, которые образуются быстро и могут привести к необходимости жертвовать животным раньше.
В идеале, опухоли поджелудочной железы должны быть быстро усваивается после сбора урожая и подготовлены для стимуляции ex vivo немедленно. Однако, это не может быть возможным, если есть большая партия опухолей для сбора урожая, в этом случае опухоли должны храниться на льду и переваривается партиями. Тип, концентрация и длина воздействия пищеварительных ферментов все было показано, влияют на большое количество молекул поверхности на иммунных клетках30,31,32. Время пищеварения также намеренно короткий, чтобы ограничить гибель клеток33. Переваренные клетки могут быть заморожены в замораживании среды для длительного хранения; однако, некоторые потери клеток произойдет при оттаивании. Процесс пищеварения может быть менее оптимальным, если опухоли части не достаточно кубиками до инкубации коллагеназы, и это будет очевидно, как твердые части опухоли останется в фильтре после пищеварения. Концентрация коллагеназы может быть снижена при работе со здоровыми опухолями поджелудочной железы или на ранних стадиях; отчеты о извлечении здоровых клеток протоков поджелудочной железы использовать значительно более низкие концентрации34. Высокая степень эпителиальной смерти клеток следует ожидать во время пищеварения; однако, иммунные клетки должны терпеть процесс наилучшим образом. Существуют альтернативные методы для изоляции жизнеспособных эпителиальных клеток для роста органоидов35 или для сохранения архитектуры тканей36.
Изменения в протокол стимуляции могут быть сделаны легко, в зависимости от желаемого чтения и иммунной клетки проанализированы (например, макрофаги или В-клетки). Использование пан-стимуляции реагентов PMA/ionomycin не дискриминирует для TCR-антигена специфичность, что делает его полезным, когда антиген не известно. Тем не менее, производство IFN з тесно связано с TCR взаимодействия37 и как IFN и TNF’ производства имеют решающее значение в PDAC противоопухолевых ответов38. PmA/ionomycin стимуляция отражает максимальную способность Т-клеток производить цитокины, которые могут или не могут быть произведены Т-клеток в микроокружении опухоли. Эндогенное производство может быть измерено без необходимости стимуляции; однако уровни могут быть гораздо ниже или необнаруживаемы. Существуют альтернативные методы стимулирования Т-клеток: бусы с покрытием против CD3/28, которые также не требуют антигена или даже других популяций иммунных клеток. Преимущество этого метода позволяет количественно количественно йокуикина производства конкретных подмножеств Т-клеток без необходимости для методов разделения. Другие маркеры цитотоксичности (гранзим B и Перфорин А), активность (IL-2) или иммуносупрессия (IL-10) также могут быть добавлены21. Однако высококачественные цитометрические антитела потока не доступны для обнаружения всех цитокинов и факторов интереса. Поэтому, если Есть другие приложения, такие как ELISA требуется стимуляция может быть выполнена без включения brefeldin A / monensin, что позволяет высвобождение цитокинов в супернатант. Однако, следует отметить, что это позволит полное высвобождение клеточного цитокинов и не будет возможно определить, какие популяции клеток способствовали.
Производство ИФНЗ является доминирующей особенностью противоопухолевой реакции Т-клеток, часто используемой в качестве замены для распознавания TCR-антигена37,38. Другие методы in vivo, которые более точно определяют антиген-специфические реакции, используют опухолевые клетки, выражающие известный антиген, такие как Ovalbumin или SV40. Универсальный антиген может быть использован ex vivo для проверки распознавания Т-клеток или в сочетании с мышью с ограниченным tCR.йохом. Кроме того, где антиген неизвестен, количественная оценка расширения клонального Т-клеток может быть выполнена путем секвенирования объемных ТКР, или в последнее время одноклеточного TCR секвенирования39,40. Чтобы полностью понять состояние внутриопухолевой Реакции Т-клеток, маркеры, свидетельствуют об истощении или ингибирующих рецепторах, также должны быть измерены в том числе: CTLA-4, PD-1, LAG-3, TIM3, 2B4. А также маркеры эффектора Т-клеток (CD44привет, CD62lo) и пролиферативной активности, Ki67или CSFE разбавления41,42,43,44. В целом, ортотопическая модель обеспечивает полезную платформу для быстрого тестирования терапевтических стратегий, в частности, которые могут модулировать противоопухолевую реакцию Т-клеток, которая затем может быть проверена на меньшей когорте трансгенных, КПК, мышей.
The authors have nothing to disclose.
Мы хотели бы поблагодарить Службу зоотехников и д-ра Алзбету Таларовикова (Институт рака Бартса, Лондонский университет королевы Марии, Лондон, Великобритания) за помощь во время ортотопической операции. Мы также хотели бы поблагодарить д-ра Дженнифер Мортон (Beatson Institute for Cancer Research, Глазго, Великобритания) за ее руководство в хирургической технике, доктора Кристину Гирелли (Институт рака Бартса, Лондонский университет королевы Марии, Лондон, Великобритания) за ее советы по пищеварению опухолей и д-р Фабьен МакКланахан (Институт рака Бартса, Университет Королевы Марии, Лондон, Великобритания) Мы также хотели бы поблагодарить Медицинский научно-исследовательский совет (MRC), Фонд исследований рака поджелудочной железы (PCFR) и борьбе с раком яичников, которые финансировали это исследование.
6/0 gauge coated vicryl absorbable sutures | Ethicon | W9500T | |
70 μm pore-size cell strainer | Fisher Scientific | 11597522 | |
9 mm Clay Adams clips | VetTech Solutions | IN015A | |
anti-CD107a PE (clone 1D4B) | Biolegend | 121612 | 1:100 to culture media |
anti-CD16/CD32 | BD Biosciences | 553142 | Use at final dilution 1:200 |
anti-CD3 PerCP eFluor710 (clone 17A2) | Biolegend | 46-0032 | Use at final dilution 1:50 |
anti-CD4 FITC (clone GK1.5) | eBioscience | 11-0041 | Use at final dilution 1:100 |
anti-CD45 Brilliant Violet 605 (clone 30-F11) | Biolegend | 103140 | Use at final dilution 1:200 |
anti-CD8 Brilliant Violet 421 (clone 53-6.7) | Biolegend | 100738 | Use at final dilution 1:100 |
anti-IFN-gamma PE/Cy7 (clone XMG1.2) | Biolegend | 505826 | Use at final dilution 1:50 |
anti-TNF-alpha Alexa Fluor 647 (clone MP6-X) | Biolegend | 506314 | Use at final dilution 1:50 |
BD Matrigel Basement Membrane Matrix High Concentration | BD Biosciences | 354248 | Aliquot on ice and store in -20 °C |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4503 | |
Cell Stimulation Cocktail (500x) (phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) and ionomycin) | eBioscience | 00-4970-03 | 1x Final concentration PMA 0.081 μM, ionomycin 1.34 μM |
Clay Adams Autoclip Applier | VetTech Solutions | IN015B | |
Clay Adams Autoclip remover | VetTech Solutions | IN015B | |
Collagenase Type V from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C9263 | 2 mg/mL in media |
Dimethyl sulphoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650-100mL | |
DMEM High glucose (4.5 g/L) with L-Glutamine | PAA | E15-810 | |
DNase (Deoxyribonuclease I from bovine pancreas Type II-S) stock 10 mg/mL in 0.15 M NaCl | Sigma-Aldrich | D4513 | Final concentration in digestion media 0.025 mg/mL |
Fixable Viability Dye 506 (FVD506) | eBioscience | 65-0866 | Use at 1:200 in PBS |
Foetal calf-serum (FCS) | GE Healthcare | A15-104 | 10% in RPMI |
Hamilton syringe 700 series, 25 μL volume, 22s gauge needle bevel tip | Fisher Scientific | 10100332 | |
Intracellular Fixation buffer and Intracellular Permeabilisation Buffer | eBioscience | 88-8824-00 | Dilute permeabilisation buffer to 1x in H2O |
Penicillin/streptomycin | PAA | 15140122 | 100 units/mL Penicillin, 100 μg/mL Streptomycin |
Protein transport inhibitor cocktail (500x) (brefeldin A and monesin) | eBioscience | 00-4980-03 | 1x Final concentration Brefeldin A 10.6 μM, monensin 2 μM |
RPMI-1640 (containing 0.3 g/L Glutamine) | Sigma-Aldrich | R8758 | |
Surgical Scalpel Blade No.10 | Swann-Morton | 0501 | |
Trypsin-EDTA Solution 10x | Sigma-Aldrich | 594-18C | Trypsin (0.1%) EDTA (0.4%) final concentration |
U-bottomed 96 microwell plate | VWR | 734-2080 | |
Universal Cotton Tipped Applicators – 6 inch x 100 | Medisave | UN982 | |
V-bottomed 96 microwell plate | VWR | 735-0184 |