Blodbaserte biomarkører for nevrodegenerative sykdommer er avgjørende for implementering av store kliniske studier. En pålitelig og validert blodprøve bør kreve et lite prøvevolum samt være en mindre invasiv prøvetakingsmetode, rimelig og reproduserbar. Dette papiret viser at høy gjennomstrømning kapillær elektroforese immunoassay tilfredsstiller kriterier for potensiell biomarkørutvikling.
Kapillær elektroforese immunoassay (CEI), også kjent som kapillær vestlig teknologi, blir en metode for å screene sykdomsrelevante proteiner og legemidler i kliniske studier. Reproduserbarhet, følsomhet, lite prøvevolumbehov, multiplekseringsantistoffer for flere proteinmerking i samme prøve, automatisert høy gjennomstrømningsevne til å analysere opptil 24 individuelle prøver, og korttidskrav gjør CEI fordelaktig over den klassiske vestlige blot immunoassay. Det er noen begrensninger av denne metoden, for eksempel manglende evne til å bruke en gradient gel (4% -20%) matrise, høy bakgrunn med uraffinerte biologiske prøver og kommersiell utilgjengelighet av individuelle reagenser. Dette papiret beskriver en effektiv metode for å kjøre CEI i en flere analyseinnstilling, optimalisere proteinkonsentrasjon og primær antistofftitrering i en analyseplate, og gi brukervennlige maler for prøveforberedelse. Også beskrevet er metoder for måling av pan TDP-43 og fosforylert TDP-43 derivat i blodplatelysat cytosol som en del av initiativet i blodbasert biomarkørutvikling for nevrodegenerative sykdommer.
Det overordnede målet med CEI som beskrevet her er å gi en oppdatert trinnvis protokoll for å analysere målproteiner i menneskelige blodplater. Tildeling av et blodbasert signaturmolekyl er en av de viktigste oppgavene innen biomarkørutvikling i humane nevrodegenerative sykdommer, som Alzheimers sykdom (AD), amyotrofisk lateral sklerose (ALS), frontotemporal lobar degenerasjon (FTLD), Parkinsons sykdom (PD), inkluderingskroppsmyositt (IBM) og andre proteinaggregasjonsrelevante patologiske tilstander. Påvisning av små mengder slike signaturproteiner i store mengder blod med mange forstyrrende midler er en utfordring. Derfor er spesifisitet, følsomhet, evne til å håndtere et stort antall prøver, og reproduserbarhet av den valgte metoden avgjørende.
Menneskelige blodplater kan tjene som et miljø for å identifisere og tildele potensielle biomarkørproteiner for nevrodegenerativ sykdom. Blodplater gir mulighet til å tjene som en surrogat primær cellemodell, som gjenspeiler noen funksjoner i nevronale celler1,2,3. Det er visse funksjoner som gjør blodplater til et av de foretrukne måtene å analysere biomarkørkandidatproteiner og deres kjemiske derivater. Først kan blodplater enkelt kjøpes ved hjelp av en mindre invasiv tilnærming ved å samle blod fra donorer (dvs. venipunktur) eller i store volumer fra samfunnets blodbanker. For det andre kan blodplater enkelt isoleres fra hele blodet med minimalt forberedende arbeid i minimalt utstyrte laboratorier4,5. Tredje, blodplater har ikke kjerner; Derfor er de en god modellcelle for å studere endringer i metabolisme uten transkripsjonsregulering. For det fjerde er biomolekylinnholdet i blodplater innkapslet; Derfor beskytter blodplatemikromiljøet innholdet mot serumforstyrrende stoffer (dvs. proteaser). Femte, blodplateberiket plasma kan lagres ved romtemperatur i 7-8 dager uten å miste metabolsk aktivitet. Blodplater gir derfor en arbeidsmodell der eksterne faktorer minimeres og kontrolleres.
Tradisjonelle immunanalyseteknikker som immunblotting (f.eks. vestlig flekking) og enzymbundet immunosorbent analyse (ELISA) er mer utbredt i spesifikk proteinanalyse. Disse to metodene har imidlertid flere ulemper, inkludert flere analysetrinn, krav til farlige kjemikalier og reagenser, stor utvalgsstørrelse, problemer med analysereproduserbarhet og inter-run datavariabilities. Disse førte til utviklingen av en metode som er enklere med færre trinn og oppnåelig i en relativt kort periode. Selv om den klassiske vestlige blot teknikken vil forbli en populær laboratoriemetode, sin multi-trinns prosedyre, forsyninger, giftig avfall (dvs. akrylamid, metanol, etc.) og analysetid blir mindre ønskelig når du utfører høy gjennomstrømming kvantitative proteinanalyse.
En automatisert CEI tilnærming blir gradvis en metode for valg for laboratorier som utfører høy gjennomstrømning protein analyser6. CEI eliminerer behovet for geler, gelelektroforeseapparater, membraner, elektroforese og elektrooverføringsenheter, og mer fysisk håndteringsinvolvering. Hvis det er utformet godt, bør en CEI-analyse fullføres innen ca. 3,5 timer, inkludert kvantitativ dataanalyse, elektropherogrammet av publikasjonskvalitet og grafer med statistisk analyse. En annen overlegenhet av CEI-systemet er kravet om 10x-20x mindre proteinkonsentrasjon, noe som gjør den ideell for bruk i menneskelige prøver som brukes i kliniske studier7,8.
Den mest kritiske delen av CEI optimaliserer analyseforholdene for hvert antistoff kjøpt fra forskjellige leverandører, type antistoff (monoklonal vs. polyklonale), optimale proteinkonsentrasjoner, prøveforberedelse, prøvedenatureringstemperatur og elektroforesespenning påkapillærene. Vi har utviklet en optimaliseringsmetode for enkeltanalyseformat for CEI som bør implementeres før nye analyser, noe som vil spare tid og ressurser. Dette optimaliseringstrinnet etterfølges av en automatisert kvantitativ vurdering av både total og fosforylert derivat av transaktiveringsrespons DNA/RNA bindingsprotein (TARDP). På grunn av størrelsen (43 kDa) vil forkortelsen TDP-43 bli brukt i hele dette papiret. Her vurderes TDP-43-protein i humant blodplatelysat hentet fra ALS-pasienter for å bidra til å utvikle prediktiv fosforyleringsverdi (PPV) som en potensiell prognostisk biomarkør.
TDP-43 er en ny potensiell sykdom biomarkør kandidat for ALS. TDP-43 er et allestedsnærværende protein i alle kjerneceller; Derfor har funksjonene til TDP-43 under ulike normale cellulære hendelser og nevrodegenerativ sykdom blitt undersøkt9,10,11,12,13,14. Selv om TDP-43 er et kjernefysisk protein15, har det evnen til å shuttle inn og ut mellom kjernen og cytoplasma på grunn av tilstedeværelsen av kjernefysisk lokalisering og kjernefysisk eksport sekvenser16,17,18,19. Cytoplasmatisk TDP-43 er involvert i ulike cellulære hendelser, som mRNA stabilitet og transport, stressrespons, mitokondriefunksjon, autophagosome20. Imidlertid er ikke mye kjent om rollen fosforylerte derivater av TDP-43 annet enn deres engasjement i patogenesen av nevrodegenerativ sykdom21.
Denne protokollen illustrerer hvordan du optimaliserer analyseforholdene for å analysere innholdet i TDP-43 og dets fosforylerte derivat i blodplater ved hjelp av CEI-tilnærmingen. Siden fosforylert TDP-43 ikke er kommersielt tilgjengelig, foreslås det å bruke en prediktiv fosforyleringsverdi (PPV) for å vurdere TDP-43-profiler hos ALS-pasienter. Dette CEI-systemet benytter et lite volum av prøveblanding (2,5–3,0 μL per kapillær). Totalt analysevolumoppsett er 8,0 μL per kapillær basert på produsentens protokoll; derfor kan forskere bruke en prøveblandingsforberedelse for to separate løp. Produsenten designet analyseprotokollen slik at eventuelle pipetteringsfeil minimeres, om ikke helt eliminert. De 24 individuelle humane blodplatelysatprøveblandingene er delt inn i halvvolumer (dvs. 2,5–3,0 μL per prøve) og analyserte de etter følgende de med to forskjellige antistoffer innen ~7 timer. CEI-systemet som er beskrevet her, gir en ønskelig analysemodalitet med høy gjennomstrømning. Brukere må teste antistoffer fra forskjellige leverandører og prøveforberedelsesmodaliteter for målproteinet før de utfører storskala screening.
Kapillær elektroforetisk-basert immunoassay er nå metoden for valg for høy gjennomstrømning prøveanalyse og narkotika screenings25. Små utvalgsvolumer, godt optimaliserte analysekomponenter, brukervennlig analyseplattform og instrumentering, reagensutgifter og lav CV-prosent er primære fordeler26,27. Selv om det finnes flere metoder for å skille proteiner i forskjellige analysemodaliteter, kan antistoffbaserte CEI beskrevet her tilpasses av små laboratorier som er engasjert i blodbasert biomarkørutvikling. CEI analyseteknologi som brukes her gir pålitelige, reproduserbare og følsomme målinger for TDP-4328 og dets fosforerte derivat5.
CEI-systemet gir også et multipleksingsvalg for å analysere TDP-43 og dets fosforylerte derivater samtidig og gi direkte kvantifisering av målproteinet, hvis renset eller rekombinant målprotein er tilgjengelig. Full lengde rekombinant TDP-43 protein er kommersielt tilgjengelig; Rekombinant fosforylert TDP-43 derivat er imidlertid ikke. Siden fosforylert TDP-43 ikke er kommersielt tilgjengelig, ble en prediktiv fosforyleringsverdi (PPV) implementert for å vurdere TDP-43-profil hos ALS-pasienter. Pan TDP-43 og fosforerte TDP-43 beløp ble permanent merket med en fluorophore; Derfor forblir TDP-43-profilen den samme med eller uten en kvantitativ enhet (dvs. ng/ml, pg/ml osv.). Selv om det å bestemme den absolutte mengden TDP-43 og dets fosforerte derivater (dvs. P [S409-410-12] TDP-43) gir en mer kvantitativ måling, eliminerer beregning av PPV nødvendigheten av den rekombinante fosforylerte TDP-43 for standardisering, siden det ikke er kommersielt tilgjengelig.
CEI gir flere kontrollpunkter i analyseplattformen for å nøyaktig identifisere problemet i tilfelle en analyse mislykkes. Dette eliminerer hindringer og gir bedre eksperimentell design. Analyseprosedyren er helautomatisk, bortsett fra å fylle prøveplaten. Dette er en betydelig funksjon sammenlignet med standard western blotting analyse. Denne funksjonen gir konsistens fra kjøring til kjøring. Selv om hvert laboratorium har unike standard driftsprosedyrer, er det viktig å følge praksis som minimerer menneskelige feil. For eksempel er det viktig å forberede luminol-S/ peroxide blandingen like før platelasting, siden å legge peroksid i luminol starter enzymatisk reaksjon og forbruker luminol substrat. Lasting av prøver og primære/sekundære antistoffer i platebrønner uten luftbobler er også kritisk viktige skritt.
I tillegg, siden platebrønnene er små i volum og det ikke er plass mellom brønner, bør brukerne være forsiktige mens de pipetterer, noe som er det viktigste trinnet siden alt annet er automatisert. Innlastingsrekkefølgen for prøvene, antistoffene og andre reagenser er viktig for konsistensen av analysen (figur 1). Prosessen med plateforberedelse tar ca 40–45 min. Derfor anbefales det å først laste platen med de nødvendige analysekomponentene og forberede luminol-S/peroxideblandingen like før pipettering. På denne måten er det en konsekvent sekvens av reagens tilsetning, og konsekvent luminescence signalstyrke vil bli oppnådd. Det anbefales ikke å bruke en utløpt luminol-S/peroxide reagens, da det primært påvirker styrken av peroksid. Nylig fremgang i innføringen av split-buffersystemet og inkludert kompatibilitetsområdet for kjemiske og vaskemidler har forbedret analysekvaliteten og produsert mer reproduserbare og forutsigbare resultater. Nå har en ny combo-analysator fra samme produsent en funksjon for å analysere prøvene merket med chemiluminescence og fluorescens konjugerte antistoffer i samme løp. Denne nye funksjonen eliminerer behovet for å kjøre to individuelle plater og eliminerer run-to-run variasjon.
Analyseplatene skal oppbevares i omgivelsestemperatur. Hvis det er valgt å holde analyseplatene i et 4 °C kjøleskap, må platene tas ut natten før analysen og bringes til omgivelsestemperatur. Feil belastede prøvebrønner må vaskes grundig (4–5 ganger) med buffer som følger med i settet før de legger til riktig prøve. Hvert primære antistoff og biologiske prøver er unike; Derfor bør antistoff-/proteinoptimaliseringen utføres før du analyserer prøvene for målproteiner i biologiske væsker.
Her ble den primære antistoffinkubasjonstiden satt til 30 min som standard. Hvis signalet er svakt, bør brukerne vurdere å øke den primære antistoffinkubasjonstiden til de når ønsket signalstyrke uten fluorescenssignalutbrenthet. For humane blodplater ble samlede prøver fra pasienter forberedt og brukt til optimaliseringsanalyse. Utvalget pooling bedre representerer variasjonen blant mål biomolekyler. Det anbefales å bruke klare supernatants i stedet for totalt lysat eller total homogenat for CEI.
Den høye konsentrasjonen av protein i hele blodplatelysatblandingen kan redusere signal-til-støy-forholdet (figur 2). Gjentatte fryse-tine sykluser av prøver bør unngås, da dette påvirker primære antistoffbindingen negativt. Ingrediensene i lysatbufferen er viktige, da noen reagenser ikke er kompatible med CEI29. Det anbefales å krysssjekke listen over kompatible reagenser som tilbys på produsentens hjemmeside før prøveforberedelse. Dette er en begrensning av systemet som ikke tolererer høye stringency forhold for prøveforberedelse. Det anbefales å optimalisere analysen kjøre parametere (dvs. primære antistoff fortynning, proteinkonsentrasjon, primære antistoff inkubasjonstid, etc.) ved hjelp av samlede prøver for senere å analysere de enkelte prøvene.
The authors have nothing to disclose.
Denne forskningen ble sponset av et intramural stipend tildelt for A.A. Dette arbeidet ble støttet av et CTSA-stipend fra NCATS tildelt University of Kansas Medical Center for Frontiers: The Heartland Institute for Clinical and Translational Research (#UL1TR606381). Innholdet er utelukkende forfatternes ansvar og representerer ikke nødvendigvis de offisielle synspunktene til NIH eller NCATS. Vi er takknemlige for University of Kansas Medical Center ALS klinikk personlig for å få IRB godkjenning for blodprøve samling fra sunn frivillig og ALS pasienter. Forfatterne takker Emre Agbas for korrekturlesing av manuskriptet.
12-230 kDa Separation kit | ProteinSimple | SM-W004 | Contains pre-filled assay plate and 25-channel capillary cartridge |
3000G Thermocycler | Techne | FTC3G/02 | We used this thermocylcer for heating the sample mix |
Anti-Mouse detection kit | ProteinSimple | 042-205 | Includes HRP-conjugated secondary antibody, buffer, luminol reagent, molecular weight marker |
Anti-P(S409-410) TDP-43 antibody | ProteinTech | 22309-1-AP | Primary antibody that recognizes phosphorylated TDP-43 |
Anti-P(S409-412) TDP-43 antibody | CosmoBio-USA | TIP-PTD-P02 | Primary antibody that recognizes phosphorylated TDP-43 |
Anti-Rabbit detection kit | ProteinSimple | DM-001 | Includes HRP-conjugated secondary antibody, buffer, luminol reagent, molecular weight marker |
Anti-TDP-43 (pan) antibody | ProteinTech | 10782-2-AP | Primary antibody that recognizes whole TDP-43 protein |
Compass for SimpleWestern (SW) | ProteinSimple | Ver.4.0.0. | Compass for SW is the control and data analysis application for SimpleWestern instruments |
Sonic Dismembrator; Model100 | Fisher Scientific | Sonicator. Used to rupture the cell membrane. This model is discontinued (Model XL2000-350) | |
Table top centrifuge | Eppendorf | 22625004 | Model# 5810 with swinging plate bucket |
Wes analyzer | ProteinSimple | 55892-WS-2203 | Performs the capillary gel electrophoresis |