Test målrettede behandlinger i kræft ved hjælp af strukturel dna ændringsanalyse og patient-afledte Xenografts

Summary

Her præsenterer vi en protokol til at teste effekten af målrettede behandlinger udvalgt baseret på den genomiske makeup af en tumor. Protokollen beskriver identifikation og validering af strukturelle DNA-rearrangements, indpodning af patienters tumorer i mus og test reaktioner på tilsvarende lægemidler.

Abstract

Vi præsenterer her en integrativ tilgang til test af effekten af målrettede behandlinger, der kombinerer den næste generation sekventering technolo-gies, terapeutiske målanalyser og lægemiddelrespons overvågning ved hjælp af patient afledte xenografts (PDX). Denne strategi blev valideret ved hjælp af ovarietumorer som et eksempel. Mate-pair næste generation sekventering (parlamentsmedlemmereq) protokol blev brugt til at identificere strukturelle ændringer og efterfulgt af analyse af potentielt målbare ændringer. Humane tumorer dyrket i immunkompromitterede mus blev behandlet med lægemidler udvalgt baseret på de genomiske analyser. Resultaterne viste en god sammenhæng mellem de forventede og de observerede svar i PDX-modellen. Den præsenterede tilgang kan bruges til at teste effekten af kombinationsbehandlinger og støtte personlig behandling for patienter med tilbagevendende kræft, specielt i tilfælde, hvor standardbehandling mislykkes, og der er behov for at bruge lægemidler off label.

Introduction

Patient-afledte xenografts (PDXs), som er genereret fra implantation af patienten tumor stykker i immundefekt mus, har vist sig som en kraftfuld præklinisk model til støtte personlig anti-cancer pleje. PDX modeller er blevet udviklet med succes for en række menneskelige maligniteter. Disse omfatter brystkræft og kræft i æggestokkene, maligne melanom, kolorektal cancer, pancreas adenocarcinom, og ikke-småcellet lungekræft^1,,2,,3,,4,5. Tumorvæv kan implanteres ortopisk eller heterotopisk. Førstnævnte, betragtes som mere præcise, men teknisk vanskeligt, indebærer transplantation direkte ind i orgel af tumor oprindelse. Disse typer af modeller menes at præcist efterligne histologi af den oprindelige tumor på grund af den “naturlige’ mikromiljø for tumor^6,7. For eksempel, orthotop transplantation i bursa af mus æggestok resulterede i tumor formidling i bughulen og produktion af ascites, typisk for kræft i æggestokkene⁸. Tilsvarende, injektion af bryst tumorer i brystkassen i stedet for abdominal mælkekirtlen påvirket PDX succesrate og adfærd⁹. Men, orthotop modeller kræver avancerede billeddannelse systemer til at overvåge tumorvækst. Heterotopisk implantation af solid tumor udføres typisk ved at implantere væv i den subkutane flanke af en mus, som giver mulighed for lettere overvågning af tumorvækst og er billigere og tidskrævende⁷. Men, tumorer vokset subkutant sjældent metastasere i modsætning til som observeret i tilfælde af orthotop implantation¹⁰.

Succesraten for engraftment har vist sig at variere og i høj grad afhænge af tumortype. Mere aggressive tumorer og væv prøver, der indeholder en højere procent af tumorceller blev rapporteret at have bedre succesrater^12,,13. I overensstemmelse med dette, tumorer stammer fra metastatiske steder blev vist sig at indpode ved frekvenser på 50-80%, mens dem fra primære steder engraft ved frekvenser så lavt som 14%¹². I modsætning hertil, væv, der indeholder nekrotiske celler og færre levedygtige tumorceller indpode dårligt. Tumorvækst kan også fremmes ved tilsætning af kældermembran matrix proteiner i vævsblandingen på tidspunktet for injektionen i^{mus 14 uden} at gå på kompromis med egenskaberne af den oprindelige tumor. Størrelsen og antallet af vævsstykker beregnet til implantation viste sig også at påvirke succesraten for engraftment. Større tumor take-rates blev rapporteret til implantation i sub-renal kapsel sammenlignet med subkutan implantation på grund af evnen af sub-renal kapsel til at opretholde den oprindelige tumor stroma og give værten stromale celler^{samt 15}.

De fleste undersøgelser bruger NOD / SCID immundefekt mus, som mangler naturlige dræberceller¹⁶ og har vist sig at øge tumor engraftment, vækst og metastase sammenlignet med andre stammer¹⁴. Men, yderligere overvågning er nødvendig, da de kan udvikle thymiske lymfomer så tidligt som 3-4 måned i alderen¹³. I ovarietumor transplantationer dyrket i SCID mus, udvækst af B-celler blev med held hæmmet af rituximab, forhindrer udviklingen af lymfomer, men uden at påvirke engraftment af æggestokkene tumorer¹⁷.

For nylig, NSG (NOD. Cg-Prkdc^scid Il2rg^tm1Wjl/SzJ) mus, der transporterer en null mutation i genet kodning interleukin 2 receptor gamma kæde¹⁸, blev en hyppigt anvendt stamme til generering af PDX modeller. Tumorer fra etablerede PDX modeller passageet til fremtidige generationer af mus er rapporteret at bevare histologiske og molekylære egenskaber for 3 til 6 generationer^19,20. Talrige undersøgelser har vist, at behandlingsresultaterne i PDX-modeller efterligner resultaterne af deres tilsvarende patienter^{2,,3,,4,,21,,22,23}. Responsraten på kemoterapi i PDX-modeller for ikke-små lungekræft og kolorektal karcinomer svarede til responsraten i kliniske forsøg med de samme^{lægemidler 24,25}. Undersøgelser udført i PDX-modeller, der blev udviklet til patienter, der indgik i kliniske forsøg, viste respons på testede lægemidler svarende til dem, der blev observeret klinisk hos^{tilsvarende patienter 2,,3,,4.}

High-throughput genomiske analyser af en patient tumor i forbindelse med PDX modeller giver et kraftfuldt værktøj til at studere korrelationer mellem specifikke genomiske ændringer og en terapeutisk respons. Disse er beskrevet i nogle få publikationer^26,27. For eksempel, terapeutiske reaktioner på EGFR-hæmmer cetuximab i et sæt af kolorektal PDX modeller transporterer EGFR forstærkning, parallelle kliniske reaktioner på cetuximab hos patienter²⁸.

Der er et par udfordringer forbundet med udvikling og anvendelse af PDX-modeller. Blandt dem er tumor heterogenitet^29,30, der kan kompromittere nøjagtigheden af behandling respons fortolkning som en enkelt celle klon med højere proliferativ kapacitet inden for en PDX kan vokse de andre^{dem 31}, hvilket resulterer i et tab af heterogenitet.^, Derudover, når enkelt tumor biopsier bruges til at udvikle PDX, nogle af de cellepopulationer kan blive savnet og vil ikke være repræsenteret i den endelige graft. Flere prøver fra samme tumor anbefales til implantation for at løse dette problem. Selvom PDX tumorer tendens til at indeholde alle de celletyper af den oprindelige donor tumor, disse celler er gradvist erstattet af dem af murine oprindelse³. Samspillet mellem murine stroma og menneskelige tumorceller i PDX modeller er ikke godt forstået. Ikke desto mindre, stromale celler blev vist sig at opsummere tumor mikromiljø³³.

På trods af disse begrænsninger er PDX-modeller fortsat blandt de mest værdifulde værktøjer til translationel forskning samt personlig medicin til udvælgelse af patientbehandlinger. Større anvendelser af PDXs omfatter biomarkør opdagelse og drug test. PDX-modellerne anvendes også med succes til at undersøge lægemiddelresistenssmekanismer og identificere strategier til at overvinde^{resistens 34,35}. Denfremgangsmåde, der er beskrevet i dette manuskript gør det muligt for forskeren at identificere potentielle terapeutiske mål i menneskelige tumorer og til at vurdere effekten af tilsvarende lægemidler in vivo , i mus huser indkapslet tumorer, som oprindeligt var genomisk karakteriseret. Protokollen bruger ovarietumorer engrafted intraperitoneally men gælder for enhver form for tumor tilstrækkeligt aggressiv til at vokse i mus^2,,3,12.

Protocol

Friske væv fra samtykkende patienter med kræft i æggestokkene blev indsamlet på tidspunktet for debulking kirurgi i henhold til en protokol godkendt af Mayo Clinic Institutional Review Board (IRB). Alle dyreforsøg og behandlinger, der anvendes i denne protokol blev godkendt af Mayo Clinic Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) og fulgte retningslinjer for dyrepleje. 1. Mate par sekvensering og analyser BEMÆRK: Enten skal der anvendes frisk eller fla…

Representative Results

Væv fra resected ovarietumorer på tidspunktet for debulking operationer blev indsamlet i overensstemmelse med IRB vejledning og anvendes til 1) genomisk karakterisering og 2) engraftment i immunkompromitterede mus (Figur 1). Mate-par sekventering protokol36,37 blev brugt til at identificere strukturelle ændringer i DNA herunder tab, gevinster og forstærkninger. Et repræsentativt genomplot, der illustrerer et landskab af genomisk…

Discussion

Vi beskriver den tilgang og protokoller, vi brugte til at gennemføre en “klinisk forsøg” i PDX modeller, der udnytter molekylære egenskaber af tumoren som opnået ved genomisk profilering at bestemme det bedste valg af lægemidler til test. Flere sekventering platforme er i øjeblikket anvendes til genomisk karakterisering af primære tumorer, herunder hele genom sekventering, RNAseq og tilpassede genpaneler. For høj kvalitet serøs ovariekarcinom, ParPseq at identificere strukturelle ændringer, DNA rearrangements o…

Materials

3M Vetbond	3M, Co.	1469SB
anti-AKT antibody	Cell Signaling Technologies, Inc.	9272
Anti-GAPDH antibody(G-9)	Santa Cruz Biotech. Inc.	sc-365062
Anti-MAPK antibody	Cell Signaling Technologies, Inc.	9926
Anti-phospho-AKT antibody	Cell Signaling Technologies, Inc.	9271
Anti-mTOR antibody	Cell Signaling Technologies, Inc.	2972
Anti-Phospho-mTOR antibody	Cell Signaling Technologies, Inc.	2971
Anti-Phospho-S6 antibody	Cell Signaling Technologies, Inc.	4858
Anti-Rictor antibody	Cell Signaling Technologies, Inc.	2114
Anti-S6 antibody	Cell Signaling Technologies, Inc.	2217
Captisol	ChemScene, Inc.	cs-0731
Carboplatin	NOVAPLUS, Inc.	61703-360-18
DMEM	Mediatech, Inc.	10-013-CV
Easy-A Hi-Fi PCR Cloning Enzyme	Agilent, Inc.	600404-51
Lubricant	Cardinal Healthcare	82-280
Matrigel	Corning, Inc.	356234
McCoy's media	Mediatech, Inc.	10-050-CV
MK-2206	ApexBio, Inc.	A3010
MK-8669	ARIAD Pharmaceuticals, Inc.	AP23573
Nair Sensitive Skin	Church & Dwight Co.	Nair Hair Remover Shower Power Sensitive
NOD/SCID mice	Charles River, Inc.	NOD.CB17-Prkdcscid/NCrCrl
Paclitaxel	NOVAPLUS, Inc.	55390-304-05
PEG400	Millipore Sigma, Inc.	88440-250ML-F
Perjeta	Genetech, Co.	Pertuzumab
Rituximab	Genetech, Co.	Rituxan
RPMI1640	Mediatech, Inc.	10-040-CV
SCID mice	Harlan Laboratories, Inc.	C.B.-17/IcrHsd-PrkdcscidLystbg
SLAx 13-6MHz linear transducer	FUJIFILM SonoSite, Inc	HFL38xp
SonoSite S-series Ultrasound machine	FUJIFILM SonoSite, Inc	SonoSite SII
Tween 80	Millipore Sigma, Inc.	P4780-100ML