Yapısal DNA Alterasyon Analizi ve Hasta Kaynaklı Ksenogreftler Kullanılarak Kanserde Hedefli Tedavilerin Test Edilmesi
Summary
Burada bir tümörün genomik yapısına dayalı olarak seçilen hedefe yönelik tedavilerin etkinliğini test etmek için bir protokol sayılacağız. Protokol, yapısal DNA düzenlemelerinin tanımlanması ve doğrulanması, hastaların tümörlerinin farelere engraftasyonu ve ilgili ilaçlara verilen yanıtların test edilmesi olarak tanımlanmaktadır.
Abstract
Burada, teknolo-gies dizilimi, terapötik hedef analizleri ve hasta kaynaklı ksenogreftler (PDX) kullanılarak ilaç yanıt takibini birleştiren hedefli tedavilerin etkinliğini test etmek için bütünleştirici bir yaklaşım salıyoruz. Bu strateji örnek olarak yumurtalık tümörleri kullanılarak doğrulandı. Yapısal değişiklikleri tanımlamak ve potansiyel olarak hedeflenebilir değişikliklerin analizini takip etmek için çift çifti yeni nesil sıralama (mPseq) protokolü kullanılmıştır. İmmün azılmış farelerde yetişen insan tümörleri genomik analizlere dayalı olarak seçilen ilaçlarla tedavi edildi. Sonuçlar, PDX modelinde öngörülen ve gözlenen yanıtlar arasında iyi bir korelasyon olduğunu göstermiştir. Sunulan yaklaşım kombinasyon tedavilerinin etkinliğini test etmek ve tekrarlayan kanserli hastalar için kişiselleştirilmiş tedaviye yardımcı olmak için kullanılabilir, özellikle standart tedavinin başarısız olduğu ve etiket dışı ilaçların kullanılmasına ihtiyaç duyulduğu durumlarda.
Introduction
Hasta tümör parçalarının immünoeksik farelere implantasyonundan elde edilen hasta kaynaklı ksenogreftler (PDXs), kişiselleştirilmiş anti-kanser bakımına yardımcı olmak için güçlü bir preklinik model olarak ortaya çıkmıştır. PDX modelleri çeşitli insan maligniteleri için başarıyla geliştirilmiştir. Bu meme ve yumurtalık kanserleri dahil, malign melanom, kolorektal kanser, pankreas adenokarsinom, ve küçük hücreli dışı akciğer kanseri1,2,3,4,5. Tümör dokusu ortonik veya heterotopik olarak implante edilebilir. Eski, daha doğru ama teknik olarak zor olarak kabul, tümör kökenli organa doğrudan nakli içerir. Modellerin Bu tür tam tümör için “doğal’ mikroenvironment nedeniyle orijinal tümörün histoloji taklit inanılmaktadır6,7. Örneğin, fare over bursa içine ortotopik transplantasyon periton boşluğuna tümör yayılması ve asit üretimi ile sonuçlandı, yumurtalık kanseri tipik8. Benzer şekilde, karın meme bezi yerine torasik içine meme tümörlerinin enjeksiyonu PDX başarı oranı ve davranış ını etkiledi9. Ancak, ortotopik modeller tümör büyümesini izlemek için gelişmiş görüntüleme sistemleri gerektirir. Solid tümörün heterotopik implantasyonu genellikle tümör büyümesinin daha kolay izlenmesine olanak sağlayan ve daha az pahalı ve zaman alıcı bir farenin deri altı kanadına doku implante edilerek yapılır7. Ancak, subkutan olarak yetiştirilen tümörler ortotopik implantasyon durumunda gözlenenden farklı olarak nadiren metastaz10.
Engraftment başarı oranı ve büyük ölçüde tümör tipine bağlı olarak değişmektedir gösterilmiştir. Daha agresif tümörler ve tümör hücrelerinin daha yüksek bir yüzdesi içeren doku örnekleri daha iyi başarı oranlarıolduğu bildirilmiştir 12,13. Bununla tutarlı olarak metastatik bölgelerden elde edilen tümörlerin %50-80 frekanslarda engraft olduğu, primer bölgelerden engraft olanların ise %1412gibi düşük frekanslarda engraft olduğu gösterilmiştir. Buna karşılık, nekrotik hücreleri ve daha az canlı tümör hücreleri içeren doku kötü engraft. Tümör büyümesi de orijinal tümörün özelliklerinden ödün vermeden fareler içine enjeksiyon sırasında doku karışımı içine bazal membran matris proteinlerin eklenmesi ile teşvik edilebilir14. İmplantasyon için tasarlanmış doku parçalarının büyüklüğü ve sayısının da engraftment başarı oranını etkilediği bulunmuştur. Sub-renal kapsülün orijinal tümör stromasını koruyabilmesi ve konak stromal hücrelerinin yanı sıra15’inisağlayabileceği nden dolayı subkutan implantasyona göre alt renal kapsülde implantasyon için daha fazla tümör alma oranları bildirilmiştir.
Çoğu çalışmada NOD / SCID immüneksikedici fareler kullanın, hangi doğal öldürücü hücreleri eksikliği16 ve tümör engraftment artırmak için gösterilmiştir, büyüme ve metastaz diğer suşları ile karşılaştırıldığında14. Ancak, 13 yaş13’ün3-4 aylık kadar erken bir döneminde timik lenfomalar gelişebileceğinden ek izleme gereklidir. SCID farelerde yetiştirilen yumurtalık tümör naklinde, B hücrelerinin büyümesi ritukimab tarafından başarılı bir şekilde inhibe edildi, lenfomaların gelişimini engelledi ama yumurtalık tümörlerinin engraftment etkilemeden17.
Daha yakın zamanda, NSG (NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) fareler, interlökin 2 reseptör gama zinciri18kodlayan gende null mutasyon taşıyan, PDX modellerinin üretimi için sık kullanılan bir suş haline geldi. Farelerin gelecek nesillere geçişkurulan PDX modellerinden tümörler 3 ila 6 nesil19,,20için histolojik ve moleküler özellikleri korumak için bildirilmiştir. Çok sayıda çalışma, PDX modellerinde tedavi sonuçlarının karşılık gelen hastaların2,3,4,,21,22,23olanları taklit ettiğini göstermiştir. Küçük olmayan akciğer kanseri ve kolorektal karsinomlar için PDX modellerinde kemoterapi yanıt oranı aynı ilaçlar için klinik çalışmalarda benzerdi24,25. Klinik çalışmalara kayıtlı hastalar için geliştirilen PDX modellerinde yapılan çalışmalarda, ilgili hastalarda klinik olarak gözlenen ilaçlara benzer test edilen ilaçlara verilen yanıtlar gösterilmiştir2,3,4.
PDX modelleri ile birlikte bir hasta tümörün yüksek-iş letme genomik analizleri, spesifik genomik değişiklikler ve terapötik yanıt arasındaki korelasyonları incelemek için güçlü bir araç sağlar. Bu birkaç yayınlar26,27açıklanmıştır. Örneğin, EGFR amplifikasyon taşıyan kolorektal PDX modelleri bir dizi EGFR inhibitörü cetuximab terapötik yanıtlar, hastalarda cetuximab paralel klinik yanıtlar28.
PDX modellerinin geliştirilmesi ve uygulanmasıile ilgili birkaç zorluk vardır. Bunlar arasında tümör heterojenite29,30 bir PDX içinde yüksek proliferatif kapasiteye sahip tek bir hücre klonu olarak tedavi yanıtı yorumlanmasının doğruluğunu tehlikeye atabilir diğer olanlar büyüyebilir31, böylece heterojenlik kaybına neden. Ayrıca, tek tümör biyopsileri PDX geliştirmek için kullanıldığında, hücre popülasyonlarının bazıları gözden kaçırılabilir ve son greftte temsil edilmez. Bu sorunu çözmek için implantasyon için aynı tümörden birden fazla örnek önerilir. PDX tümörleri orijinal donör tümörün tüm hücre tiplerini içerme eğiliminde olmasına rağmen, bu hücreler yavaş yavaş murine kökenli olanlar tarafından ikame edilir3. PDX modellerinde murine stroma ve insan tümör hücreleri arasındaki etkileşim iyi anlaşılamamıştır. Bununla birlikte, stromal hücrelerin tümör mikroçevresini recapitulate gösterilmiştir33.
Bu sınırlamalara rağmen, PDX modelleri çeviriaraştırma nın yanı sıra hasta tedavilerini seçmek için kişiselleştirilmiş tıp için en değerli araçlar arasında yer almıştır. PDX’lerin başlıca uygulamaları arasında biyomarker keşfi ve uyuşturucu testi sayılabilir. PDX modelleri de başarıyla ilaç direnci mekanizmaları çalışma ve ilaç direnci34,35üstesinden gelmek için stratejiler belirlemek için kullanılır. Bu el yazmasında açıklanan yaklaşım, araştırmacının insan tümörlerinde potansiyel terapötik hedefleri belirlemesine ve başlangıçta genomik olarak karakterize edilmiş engreftli tümörleri barındıran farelerde in vivoile ilgili ilaçların etkinliğini değerlendirmesine olanak sağlamaktadır. Protokol intraperitoneal engrafted yumurtalık tümörleri kullanır ama farelerde büyümek için yeterince agresif tümör her türlü uygulanabilir2,3,12.
Protocol
Representative Results
Discussion
PDX modellerinde genomik profilleme ile elde edilen ve test için en iyi ilaç seçimini belirleyen bir “klinik deney” yapmak için kullandığımız yaklaşım ve protokolleri tanımlıyoruz. Birden fazla sıralama platformları şu anda tüm genom dizileme, RNAseq ve özelleştirilmiş gen panelleri de dahil olmak üzere primer tümörlerin genomik karakterizasyonu için kullanılır. Yüksek dereceli seröz over karsinomu için, yapısal değişiklikleri tanımlamak için mPseq, DNA rearrangements ve kopya numarası d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Mayo Clinic Center for Individualized Medicine (CIM) Dr. Lin Yang ve Faye R. Harris, MS üyelerine deneylerin yürütülmesinde yardımcı olan üyelerine teşekkür ederiz. Bu çalışma Bay ve Bayan Neil E. Eckles’ın Mayo Clinic Center for Individualized Medicine (CIM) Için Hediyesi tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 3M Vetbond | 3M, Co. | 1469SB | |
| anti-AKT antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 9272 | |
| Anti-GAPDH antibody(G-9) | Santa Cruz Biotech. Inc. | sc-365062 | |
| Anti-MAPK antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 9926 | |
| Anti-phospho-AKT antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 9271 | |
| Anti-mTOR antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 2972 | |
| Anti-Phospho-mTOR antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 2971 | |
| Anti-Phospho-S6 antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 4858 | |
| Anti-Rictor antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 2114 | |
| Anti-S6 antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 2217 | |
| Captisol | ChemScene, Inc. | cs-0731 | |
| Carboplatin | NOVAPLUS, Inc. | 61703-360-18 | |
| DMEM | Mediatech, Inc. | 10-013-CV | |
| Easy-A Hi-Fi PCR Cloning Enzyme | Agilent, Inc. | 600404-51 | |
| Lubricant | Cardinal Healthcare | 82-280 | |
| Matrigel | Corning, Inc. | 356234 | |
| McCoy's media | Mediatech, Inc. | 10-050-CV | |
| MK-2206 | ApexBio, Inc. | A3010 | |
| MK-8669 | ARIAD Pharmaceuticals, Inc. | AP23573 | |
| Nair Sensitive Skin | Church & Dwight Co. | Nair Hair Remover Shower Power Sensitive | |
| NOD/SCID mice | Charles River, Inc. | NOD.CB17-Prkdcscid/NCrCrl | |
| Paclitaxel | NOVAPLUS, Inc. | 55390-304-05 | |
| PEG400 | Millipore Sigma, Inc. | 88440-250ML-F | |
| Perjeta | Genetech, Co. | Pertuzumab | |
| Rituximab | Genetech, Co. | Rituxan | |
| RPMI1640 | Mediatech, Inc. | 10-040-CV | |
| SCID mice | Harlan Laboratories, Inc. | C.B.-17/IcrHsd-PrkdcscidLystbg | |
| SLAx 13-6MHz linear transducer | FUJIFILM SonoSite, Inc | HFL38xp | |
| SonoSite S-series Ultrasound machine | FUJIFILM SonoSite, Inc | SonoSite SII | |
| Tween 80 | Millipore Sigma, Inc. | P4780-100ML |
References
- Tentler, J. J., et al. Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development. Nature Reviews Clinical Oncology. 9, 338-350 (2012).
- Marangoni, E., et al. A new model of patient tumor-derived breast cancer xenografts for preclinical assays. Clinical Cancer Research. 13, 3989-3998 (2007).
- Zhang, X., et al. A renewable tissue resource of phenotypically stable, biologically and ethnically diverse, patient-derived human breast cancer xenograft models. 암 연구학. 73, 4885-4897 (2013).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4, 998-1013 (2014).
- Weroha, S. J., et al. Tumorgrafts as in vivo surrogates for women with ovarian cancer. Clinical Cancer Research. 20, 1288-1297 (2014).
- Rubio-Viqueira, B., et al. Optimizing the development of targeted agents in pancreatic cancer: tumor fine-needle aspiration biopsy as a platform for novel prospective ex vivo drug sensitivity assays. Molecular Cancer Therapeutics. 6, 1079-1088 (2007).
- Rubio-Viqueira, B., Hidalgo, M. Direct in vivo xenograft tumor model for predicting chemotherapeutic drug response in cancer patients. Clinical Pharmacology and Therapeutics. 85, 217-221 (2009).
- Ricci, F., et al. Patient-derived ovarian tumor xenografts recapitulate human clinicopathology and genetic alterations. 암 연구학. 74, 6980-6990 (2014).
- Fleming, J. M., et al. Local regulation of human breast xenograft models. Journal of Cellular Physiology. 224, 795-806 (2010).
- Hoffman, R. M. Patient-derived orthotopic xenografts: better mimic of metastasis than subcutaneous xenografts. Nature Reviews Cancer. 15, 451-452 (2015).
- Jung, J., Seol, H. S., Chang, S. The Generation and Application of Patient-Derived Xenograft Model for Cancer Research. Cancer Research and Treatment. 50, 1-10 (2018).
- Sivanand, S., et al. A validated tumorgraft model reveals activity of dovitinib against renal cell carcinoma. Science Translational Medicine. 4, 137-152 (2012).
- Pavía-Jiménez, A., Tcheuyap, V. T., Brugarolas, J. Establishing a human renal cell carcinoma tumorgraft platform for preclinical drug testing. Nature Protocols. 9, 1848-1859 (2014).
- Fridman, R., Benton, G., Aranoutova, I., Kleinman, H. K., Bonfil, R. D. Increased initiation and growth of tumor cell lines, cancer stem cells and biopsy material in mice using basement membrane matrix protein (Cultrex or Matrigel) co-injection. Nature Protocols. 7, 1138-1144 (2012).
- Cutz, J. C., et al. Establishment in severe combined immunodeficiency mice of subrenal capsule xenografts and transplantable tumor lines from a variety of primary human lung cancers: potential models for studying tumor progression-related changes. Clinical Cancer Research. 12, 4043-4054 (2006).
- Siolas, D., Hannon, G. J. Patient-derived tumor xenografts: transforming clinical samples into mouse models. 암 연구학. 73, 5315-5319 (2013).
- Butler, K. A., et al. Prevention of Human Lymphoproliferative Tumor Formation in Ovarian Cancer Patient-Derived Xenografts. Neoplasia. 19, 628-636 (2017).
- Cao, X., et al. Defective lymphoid development in mice lacking expression of the common cytokine receptor gamma chain. Immunity. 2, 223-238 (1995).
- Dobbin, Z. C., et al. Using heterogeneity of the patient-derived xenograft model to identify the chemoresistant population in ovarian cancer. Oncotarget. 5, 8750-8764 (2014).
- Choi, Y. Y., et al. Establishment and characterisation of patient-derived xenografts as paraclinical models for gastric cancer. Scientific Reports. 6, 22172 (2016).
- Malaney, P., Nicosia, S. V., Davé, V. One mouse, one patient paradigm: New avatars of personalized cancer therapy. Cancer Letters. 344, 1-12 (2014).
- Rosfjord, E., Lucas, J., Li, G., Gerber, H. P. Advances in patient-derived tumor xenografts: from target identification to predicting clinical response rates in oncology. Biochemical Pharmacology. 91, 135-143 (2014).
- Braekeveldt, N., Bexell, D. Patient-derived xenografts as preclinical neuroblastoma models. Cell and Tissue Research. 372, 233-243 (2018).
- ‘Perez-Soler, R., et al. Response and determinants of sensitivity to paclitaxel in human non-small cell lung cancer tumors heterotransplanted in nude mice. Clinical Cancer Research. 6, 4932-4938 (2000).
- Fichtner, I., et al. Anticancer drug response and expression of molecular markers in early-passage xenotransplanted colon carcinomas. European Journal of Cancer. 40, 298-307 (2004).
- Gao, H., et al. High-throughput screening using patient-derived tumor xenografts to predict clinical trial drug response. Nature Medicine. 21, 1318-1325 (2015).
- Izumchenko, E., et al. Patient-derived xenografts effectively capture responses to oncology therapy in a heterogeneous cohort of patients with solid tumors. Annals of Oncology. 28, 2595-2605 (2017).
- Bertotti, A., et al. A molecularly annotated platform of patient-derived xenografts (“xenopatients”) identifies HER2 as an effective therapeutic target in cetuximab-resistant colorectal cancer. Cancer Discovery. 1, 508-523 (2011).
- Mengelbier, L. H., et al. Intratumoral genome diversity parallels progression and predicts outcome in pediatric cancer. Nature Communications. 27, 6125 (2015).
- McGranahan, N., Swanton, C. Clonal Heterogeneity and Tumor Evolution: Past, Present, and the Future. Cell. 168, 613-628 (2017).
- Marusyk, A., et al. Non-cell-autonomous driving of tumour growth supports sub-clonal heterogeneity. Nature. 514, 54-58 (2014).
- Braekeveldt, N., et al. Neuroblastoma patient-derived orthotopic xenografts reflect the microenvironmental hallmarks of aggressive patient tumours. Cancer Letters. 375, 384-389 (2016).
- DeRose, Y. S., et al. Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes. Nature Medicine. 17, 1514-1520 (2011).
- Das Thakur, M., et al. Modelling vemurafenib resistance in melanoma reveals a strategy to forestall drug resistance. Nature. 494, 251-255 (2013).
- Girotti, M. R., et al. Application of Sequencing, Liquid Biopsies, and Patient-Derived Xenografts for Personalized Medicine in Melanoma. Cancer Discovery. 6, 286-299 (2016).
- Murphy, S. J., et al. Mate pair sequencing of whole-genome-amplified DNA following laser capture microdissection of prostate cancer. DNA Research. 19, 395-406 (2012).
- Smadbeck, J. B., et al. Copy number variant analysis using genome-wide mate-pair sequencing. Genes Chromosomes and Cancer. 57, 459-470 (2018).
- Kovtun, I. V., et al. Lineage relationship of Gleason patterns in Gleason score 7 prostate cancer. 암 연구학. 73, 3275-3284 (2013).
- Paster, E. V., Villines, K. A., Hickman, D. L. Endpoints for mouse abdominal tumor models: refinement of current criteria. Comparative Medicine. 59, 234-241 (2009).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9, 671-675 (2012).
- Cheng, Y., et al. MK-2206, a novel allosteric inhibitor of Akt, synergizes with gefitinib against malignant glioma via modulating both autophagy and apoptosis. Molecular Cancer Therapeutics. 11, 154-164 (2012).
- Rivera, V. M., et al. Ridaforolimus (AP23573; MK-8669), a potent mTOR inhibitor, has broad antitumor activity and can be optimally administered using intermittent dosing regimens. Molecular Cancer Therapeutics. 10, 1059-1071 (2011).
- Heitjan, D. F., Manni, A., Santen, R. J. Statistical analysis of in vivo tumor growth experiments. 암 연구학. 53, 6042-6050 (1993).
- Vargas, R., et al. Case study: patient-derived clear cell adenocarcinoma xenograft model longitudinally predicts treatment response. NPJ Precision Oncology. 2, 14 (2018).
- Harris, F. R., et al. Targeting HER2 in patient-derived xenograft ovarian cancer models sensitizes tumors to chemotherapy. Molecular Oncology. 13, 132-152 (2019).
- Fidler, I. J., et al. Modulation of tumor cell response to chemotherapy by the organ environment. Cancer and Metastasis Reviews. 13, 209-222 (1994).
