מרבב תא יחיד mRNA ניתוח הרצף של העכבר תאים עובריים
Summary
כאן הצגנו מרבב תא יחיד mRNA שיטת רצף לביטוי גנים פרופיל ברקמות עובריים העכבר. השיטה המבוססת על droplet בודדת של תא mRNA (scRNA-Seq) בשילוב עם אסטרטגיות ריבוב יכולה לפרופיל תאים בודדים מדגימות מרובות בו זמנית, אשר מפחית באופן משמעותי את עלויות החומרים וממזער את השפעות האצווה הנסיוניות.
Abstract
רצף mRNA תא יחיד עשה התקדמות משמעותית בשנים האחרונות והפך כלי חשוב בתחום הביולוגיה ההתפתחותית. הוא השתמש בהצלחה כדי לזהות אוכלוסיות תאים נדירות, לגלות גנים סמן הרומן, ולפענח מידע התפתחותי מרחבי וזמני. שיטת התאים הבודדת התפתחה גם מתוך הטכנולוגיה המבוססת על המיקרו-פלואידיק C1 לפתרונות מבוססי-droplet בשנתיים האחרונות עד שלוש שנים. כאן השתמשנו בלב כדוגמה כדי להדגים כיצד לפרופיל את התאים מתחלקים העכבר באמצעות השיטה scRNA-Seq מבוסס droplet. בנוסף, אנו משולבים שתי אסטרטגיות לתוך זרימת העבודה כדי לפרופיל דגימות מרובות בניסוי אחד. באמצעות אחת השיטות המשולבות, יש לנו בו פרופיל יותר מ 9,000 תאים משמונה דגימות לב. שיטות אלה יהיו בעלות ערך לתחום הביולוגיה ההתפתחותית על ידי מתן דרך חסכונית לפרופיל בו תאים בודדים מרקעים גנטיים שונים, שלבים התפתחותיים, או מיקומים אנטומיים.
Introduction
הפרופיל של כל תא בודד משתנה בין אוכלוסיות תאים במהלך התפתחות מעובדיות. למרות מולקולרי אחד באתרו היברידיזציה ניתן להשתמש כדי להמחיש את הביטוי של מספר קטן של גנים1, רצף mrna תא יחיד (ScRNA-Seq) מספק גישה משוחדת כדי להמחיש דפוסי ביטוי הגנום רחב של גנים בתאים בודדים. לאחר שפורסם לראשונה ב 20092, scRNA-Seq חלה לחקור רקמות מרובות בשלבים התפתחותיים מרובים בשנים האחרונות3,4,5. כמו כן, כמו אטלס התא האנושי השיקה פרויקטים התפתחותיים שלה ממוקדת לאחרונה, יותר נתונים תא בודד מרקמות עובריים אנושיים צפויים להיווצר בעתיד הקרוב.
הלב כמו האיבר הראשון לפתח משחק תפקיד קריטי בהתפתחות עובריים. הלב מורכב מסוגי תאים מרובים והתפתחות של כל סוג תא מוסדר באופן הדוק באופן זמני ו spatially. במהלך השנים האחרונות, המקור ואת שושלת התאים של תאי לב בשלבים התפתחותיים מוקדם כבר מאופיין6, אשר לספק כלי ניווט שימושי עצום להבנת מחלת לב מולדים פתוגנזה, כמו גם לפיתוח שיטות מתקדמות יותר מבחינה טכנולוגית כדי לעורר התחדשות הקרדיוציט7.
ScRNA-Seq עברה התרחבות מהירה בשנים האחרונות8,9,10. עם שיטות שפותחו לאחרונה, עיצוב וניתוח של ניסויים תא בודד הפך השגה יותר11,12,13,14. השיטה המוצגת כאן היא הליך מסחרי המבוסס על פתרונות ה-droplet (ראה טבלת חומרים)15,16. שיטה זו כוללת לכידת תאים וסטים של חרוזי ברקודים ייחודיים ב-droplet של מי השמן, שתחת שליטה של מערכת בקרי מיקרו-פלואידיג. שיעור הטעינה של התאים בטיפות נמוך מאוד כך שרוב האמולסיות של droplet מכילים תא אחד בלבד17. העיצוב הגאוני של התהליך מגיע מהפרדה בין תאים בודדים לאמולסיות של droplet המתרחשים בו זמנית עם ברקוד, המאפשר ניתוח מקבילי של תאים בודדים באמצעות RNA-Seq באוכלוסיה הטרוגנית.
התאגדות של אסטרטגיות ריבוב היא אחת התוספות החשובות לזרימת העבודה המסורתית תא13,14. תוספת זו שימושית מאוד בסילוק תא doublets, הפחתת עלויות נסיוניות וביטול אפקטים של אצווה18,19. אסטרטגיה בסיס השומנים המבוססת על מבוסס ואסטרטגיה ברקוד מבוסס נוגדן (ראה טבלת חומרים) הם שני שיטות ריבוב משומשים בעיקר. ברקודים ספציפיים משמשים לתווית כל מדגם בשתי השיטות, והדגימות שסומנו מעורבות לאחר מכן עבור לכידת תא בודד, הכנה לספריות ורצף. לאחר מכן, הנתונים ברצף במאגר יכול להיות מופרדים על ידי ניתוח רצפי ברקוד (איור 1)19. עם זאת, הבדלים משמעותיים קיימים בין שתי השיטות. אסטרטגיית barcoding המבוססת על השומנים מבוססת על olig, שעברו שינוי השומנים, אשר לא נמצא יש העדפות סוג תא כלשהו. בעוד אסטרטגיה ברקוד מבוסס הנוגדן יכול רק לזהות את התאים המבטאים את החלבונים אנטיגן19,20. בנוסף, זה לוקח בערך 10 דקות כדי להכתים את השומנים אבל 40 דקות כדי להכתים את הנוגדנים (איור 1). יתרה מזאת, הננו-שינויים המשומנים הינם זולים יותר מאשר מצובי נוגדנים בעלי מניות, אך לא זמין באופן מסחרי בזמן כתיבת מאמר זה. לבסוף, האסטרטגיה המבוססת על השומנים יכול להיות במגה 96 דגימות בניסוי אחד, אבל האסטרטגיה מבוסס נוגדן כרגע יכול רק מאחד 12 דגימות.
מספר התא המומלץ לקולנוע בניסוי בודד צריך להיות נמוך מ 2.5 x 104, אחרת, זה יוביל אחוז גבוה של תאים doublets וזיהום mrna הסביבה הפוטנציאלית. באמצעות אסטרטגיות ריבוב, העלות של תא בודד לכידת, cDNA דור, והכנה הספריה עבור מספר דגימות יופחת לעלות של מדגם אחד אבל העלות רצף יישאר זהה.
Protocol
Representative Results
Discussion
במחקר זה, הדגמנו פרוטוקול כדי לנתח פרופילים תא יחיד הטרנססקריפט. כמו כן, סיפקנו שתי שיטות אופציונליות לדוגמיות של מולטיפלקס בזרימת העבודה scRNA-Seq. שתי השיטות הוכיחו להיות ריאלי במעבדות שונות סיפק פתרונות כדי להפעיל את הניסוי חסכוני ואצווה ללא אפקט תא יחיד18,26….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לדוד מ. פטרסון וכריסטופר ס. מק מ ד ר זאב ג. גרטנר מעבדה עבור האספקה האדיבה שלהם של ריאגנטים barcoding מבוסס ליפיד והצעות על שלבים ניסיוניים ניתוח נתונים. עבודה זו נוסדה על ידי המכון הלאומי לבריאות (HL13347202).
Materials
| 10% Tween-20 | Bio-Rad | 1610781 | |
| 10x Chip Holder | 10x Genomics | 120252 330019 | |
| 10x Chromium Controller | 10x Genomics | 120223 | |
| 10x Magnetic Separator | 10x Genomics | 120250 230003 | |
| 10x Vortex Adapter | 10x Genomics | 330002, 120251 | |
| 10x Vortex Clip | 10x Genomics | 120253 230002 | |
| 4200 TapeStation System | Agilent | G2991AA | |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | University of Pittsburgh Health Sciences Sequencing Core |
| Barcode Oligo | Integrated DNA Technologies | Single-stranded DNA | 25 nmol |
| Buffer EB | Qiagen | 19086 | |
| CD1 mice | Chales River | Strain Code 022 | ordered pregnant mice |
| Centrifuge 5424R | Appendorf | 2231000214 | |
| Chromium Chip B Single Cell Kit, 48 rxns | 10x Genomics | 1000073 | Store at ambient temperature |
| Chromium i7 Multiplex Kit, 96 rxns | 10x Genomics | 120262 | Store at -20 °C |
| Chromium Single Cell 3' GEM Kit v3,4 rxns | 10x Genomics | 1000094 | Store at -20 °C |
| Chromium Single Cell 3' Library Kit v3 | 10x Genomics | 1000095 | Store at -20 °C |
| Chromium Single Cell 3' v3 Gel Beads | 10x Genomics | 2000059 | Store at -80 °C |
| Collagenase A | Sigma/Millipore | 10103578001 | Store powder at 4 °C, store at -20 °C after it dissolves |
| Collagenase B | Sigma/Millipore | 11088807001 | Store powder at 4 °C, store at -20 °C after it dissolves |
| D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5582 | University of Pittsburgh Health Sciences Sequencing Core |
| DNA LoBind Tube Microcentrifuge Tube, 1.5 mL | Eppendorf | 022431021 | |
| DNA LoBind Tube Microcentrifuge Tube, 2.0 mL | Eppendorf | 022431048 | |
| Dynabeads MyOne SILANE | 10x Genomics | 2000048 | Store at 4 °C, used in Beads Cleanup Mix (Table 1) |
| DynaMag-2 Magnet | Theromo Scientific | 12321D | |
| Ethanol, Pure (200 Proof, anhydrous) | Sigma | E7023-500mL | |
| Falcon 15mL High Clarity PP Centrifuge Tube | Corning Cellgro | 14-959-70C | |
| Falcon 50mL High Clarity PP Centrifuge Tube | Corning Cellgro | 14-959-49A | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, United States | Fisher Scientific | 26140079 | Store at -20 °C |
| Finnpipette F1 Multichannel Pipettes, 10-100μl | Theromo Scientific | 4661020N | |
| Finnpipette F1 Multichannel Pipettes, 1-10μl | Theromo Scientific | 4661000N | |
| Flowmi Cell Strainer | Sigma | BAH136800040 | Porosity 40 μm, for 1000 uL Pipette Tips, pack of 50 each |
| Glycerin (Glycerol), 50% (v/v) | Ricca Chemical Company | 3290-32 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14170112 | |
| Human TruStain FcX (Fc Receptor Blocking Solution) | BioLegend | 422301 | Add 5 µl of Human TruStain FcX per million cells in 100 µl staining volume |
| Isopropanol (IPA) | Fisher Scientific | A464-4 | |
| Kapa HiFi HotStart ReadyMix (2X) | Fisher Scientific | NC0295239 | Store at -20 °C, used in Lipid-tagged barcode library mix (Table 1) |
| Lipid Barcode Primer (Multi-seq Primer) | Integrated DNA Technologies | Single-stranded DNA | 100 nmol |
| Low TE Buffer (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.1 mM EDTA) | Thermo Fisher Scientific | 12090-015 | |
| MasterCycler Pro | Eppendorf | 950W | |
| Nuclease-Free Water (Ambion) | Thermo Fisher Scientific | AM9937 | |
| PCR Tubes 0.2 ml 8-tube strips | Eppendorf | 951010022 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) 1X without calcium & magnesium | Corning Cellgro | 21-040-CV | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) with 10% Bovine Albumin (alternative to Thermo Fisher product) | Sigma-Aldrich | SRE0036 | |
| Pipet 4-pack (0.1–2.5μL, 0.5-10μL, 10–100μL, 100–1,000μL variable-volume pipettes | Fisher Scientific | 05-403-151 | |
| Selection reagent (SPRIselect Reagent Kit) | Beckman Coulter | B23318 (60ml) | |
| Template Switch Oligo | 10x Genomics | 3000228 | Store at -20 °C, used in Master Mix (Table 1) |
| The antibody based barcoding strategy is also known as Cell Hashing | |||
| The cell browser is Loup Cell Browser | 10x Genomics | https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/visualization/latest/what-is-loupe-cell-browser | |
| The commercial available analysis pipline in step 8.1 is Cell Ranger | 10x Genomics | https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/what-is-cell-ranger | |
| The lipid based barcoding strategy is also known as MULTI-seq | |||
| The well maintained R platform is Seurat V3 | satijalab | https://satijalab.org/seurat/ | |
| TipOne RPT 0.1-10/20 ul XL ultra low retention filter pipet tip | USA Scientific | 1180-3710 | |
| TipOne RPT 1000 ul XL ultra low retention filter pipet tip | USA Scientific | 1182-1730 | |
| TipOne RPT 200 ul ultra low retention filter pipet tip | USA Scientific | 1180-8710 | |
| TotalSeq-A0301 anti-mouse Hashtag 1 Antibody | BioLegend | 155801 | 0.1 – 1.0 µg of antibody in 100 µl of staining buffer for every 1 million cells |
| TotalSeq-A0302 anti-mouse Hashtag 2 Antibody | BioLegend | 155803 | 0.1 – 1.0 µg of antibody in 100 µl of staining buffer for every 1 million cells |
| TotalSeq-A0302 anti-mouse Hashtag 3 Antibody | BioLegend | 155805 | 0.1 – 1.0 µg of antibody in 100 µl of staining buffer for every 1 million cells |
| TrueSeq RPI primer | Integrated DNA Technologies | Single-stranded DNA | 100 nmol, used in Lipid-tagged barcode library mix (Table 1) |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Fisher Scientific | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Fisher Scientific | 25200-056 | |
| Universal I5 | Integrated DNA Technologies | Single-stranded DNA | 100 nmol |
References
- Raj, A., Van Den Bogaard, P., Rifkin, S. A., Van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nature Methods. 5 (10), 877 (2008).
- Tang, F., et al. mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell. Nature Methods. 6 (5), 377 (2009).
- Li, G., Plonowska, K., Kuppusamy, R., Sturzu, A., Wu, S. M. Identification of cardiovascular lineage descendants at single-cell resolution. Development. 142 (5), 846-857 (2015).
- DeLaughter, D. M., et al. Single-cell resolution of temporal gene expression during heart development. Developmental Cell. 39 (4), 480-490 (2016).
- Li, G., et al. Single cell expression analysis reveals anatomical and cell cycle-dependent transcriptional shifts during heart development. Development. 146 (12), dev173476 (2019).
- Meilhac, S. M., Buckingham, M. E. The deployment of cell lineages that form the mammalian heart. Nature Reviews Cardiology. 1, (2018).
- Liu, Z., et al. Single-cell transcriptomics reconstructs fate conversion from fibroblast to cardiomyocyte. Nature. 551 (7678), 100 (2017).
- Lafzi, A., Moutinho, C., Picelli, S., Heyn, H. Tutorial: guidelines for the experimental design of single-cell RNA sequencing studies. Nature Protocols. 1, (2018).
- The Tabula Muris Consortium. Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris. Nature. 562 (7727), 367 (2018).
- Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. Single-cell genome sequencing: current state of the science. Nature Reviews Genetics. 17 (3), 175 (2016).
- Grün, D., van Oudenaarden, A. Design and analysis of single-cell sequencing experiments. Cell. 163 (4), 799-810 (2015).
- Ziegenhain, C., et al. Comparative analysis of single-cell RNA sequencing methods. Molecular cell. 65 (4), 631-643 (2017).
- Hashimshony, T., et al. CEL-Seq2: sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq. Genome Biology. 17 (1), 77 (2016).
- Islam, S., et al. Characterization of the single-cell transcriptional landscape by highly multiplex RNA-seq. Genome Research. 21 (7), 1160-1167 (2011).
- Macosko, E. Z., et al. Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
- Klein, A. M., et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).
- . Library Prep -Single Cell Gene Expression -Official 10x Genomics Support Available from: https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/library-prep (2018)
- McGinnis, C. S., et al. MULTI-seq: sample multiplexing for single-cell RNA sequencing using lipid-tagged indices. Nature Methods. 1, (2019).
- Stoeckius, M., et al. Cell hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics. Genome Biology. 19 (1), 224 (2018).
- Chan, M. M., et al. Molecular recording of mammalian embryogenesis. Nature. 570 (7759), 77-82 (2019).
- . Agilent 4200 TapeStation System Available from: https://www.agilent.com/cs/library/datasheets/public/5991-6029EN.pdf (2019)
- . SPRIselect User Guide Available from: https://research.fhcrc.org/content/dam/stripe/hahn/methods/mol_biol/SPRIselect%20User%20Guide.pdf (2012)
- . Qubit 4 Fluorometer User Guide Available from: https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/MAN0017209_Qubit_4_Fluorometer_UG.pdf (2018)
- . Agilent High Sensitivity DNA Kit Guide Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/High%20Sensitivity_DNA_KG.pdf (2016)
- Butler, A., Hoffman, P., Smibert, P., Papalexi, E., Satija, R. Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species. Nature Biotechnology. 36 (5), 411 (2018).
- Weber, R. J., Liang, S. I., Selden, N. S., Desai, T. A., Gartner, Z. J. Efficient targeting of fatty-acid modified oligonucleotides to live cell membranes through stepwise assembly. Biomacromolecules. 15 (12), 4621-4626 (2014).
- . Single Cell Protocols Cell Preparation Guide Available from: https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sample-prep (2017)
