Multiplekset enkelt celle mRNA sekvensering analyse av Mouse embryonale celler
Summary
Her presenterte vi en multiplekset enkelt celle mRNA sekvensering metode for å profil genuttrykk i musen embryonale vev. Dråpe BAS ert enkelt celle mRNA sekvensering (scRNA-SEQ) metode i kombinasjon med multipleksing strategier kan profilen enkeltceller fra flere prøver samtidig, som i betydelig grad reduserer reagens kostnader og minimerer eksperimentelle satsvise effekter.
Abstract
Enkelt celle mRNA sekvensering har gjort betydelige fremskritt i de siste årene, og har blitt et viktig verktøy innen utviklingspsykologi biologi. Det har blitt brukt til å identifisere sjeldne celle populasjoner, oppdage romanen markør gener, og dekode romlige og timelige utviklingsmessige informasjon. Den enkle celle metoden har også utviklet seg fra den mikrovæskebasert baserte Fluidigm C1-teknologien til dråpe-baserte løsninger i de siste to til tre år. Her har vi brukt hjertet som et eksempel for å demonstrere hvordan å profil musen embryonale vev celler ved hjelp av dråpe basert scRNA-SEQ metode. I tillegg har vi integrert to strategier i arbeidsflyten for å profil flere prøver i et enkelt eksperiment. Ved hjelp av en av de integrerte metodene, har vi samtidig profilert mer enn 9 000 celler fra åtte hjerte prøver. Disse metodene vil være verdifulle for utviklingsbiologi feltet ved å tilby en kostnadseffektiv måte å samtidig profil enkeltceller fra ulike genetiske bakgrunner, utviklingsmessige stadier, eller anatomiske steder.
Introduction
Den transcriptional profilen til hver enkelt celle varierer mellom celle populasjoner under embryoutvikling. Selv om enkelt molekylær in situ-hybridisering kan brukes til å visualisere uttrykk for et lite antall gener1, gir én celle mRNA sekvensering (ScRNA-SEQ) en upartisk tilnærming for å illustrere uttrykks mønstre av gener i hele Genova i enkeltceller. Etter at den først ble publisert i 20092, scRNA-SEQ har blitt brukt til å studere flere vev på flere utviklingsmessige stadier i de siste årene3,4,5. Også, som den menneskelige cellen Atlas har lansert sin utviklingsmessige-fokuserte prosjekter nylig, er mer enkelt celledata fra menneskelig embryonale vev forventes å bli generert i nær fremtid.
Hjertet som første organ for å utvikle spiller en avgjørende rolle i embryoutvikling. Hjertet består av flere celletyper og utviklingen av hver celle type er strengt regulert timelig og romlig. I løpet av de siste årene, opprinnelse og celle avstamning av CARDIAC celler på tidlige utviklingsmessige stadier har vært preget6, som gir en enorm nyttig navigeringsverktøy for å forstå medfødt hjertesykdom patogenesen, samt for å utvikle mer teknologisk avanserte metoder for å stimulere cardiomyocyte regenerering7.
ScRNA-SEQ har gjennomgått en rask ekspansjon de siste årene8,9,10. Med de nyutviklede metodene har design og analyse av enkelt celle eksperimenter blitt mer oppnåelig11,12,13,14. Metoden som presenteres her er en kommersiell prosedyre basert på dråpe-løsningene (se tabell over materialer)15,16. Denne metoden har å fange celler og sett med unikt Barcoded perler i en olje-vann emulsjon dråpe under kontroll av en mikrovæskebasert Controller system. Hastigheten på celle lasting i dråpene er ekstremt lav, slik at flertallet av dråpe emulsjoner inneholder bare en celle17. Prosedyren er genial design kommer fra enkelt celle separasjon i dråpe emulsjoner forekommende samtidig med barcoding, som muliggjør parallell analyse av individuelle celler ved hjelp av RNA-SEQ på en heterogen befolkning.
Innlemmelse av multipleksing strategier er en av de viktigste tilleggene til den tradisjonelle enkelt celle arbeidsflyten13,14. Dette tillegg er svært nyttig i å forkaste celle doublets, redusere eksperimentelle kostnader, og eliminere batch effekter18,19. En lipid basert barcoding strategi og et antistoff basert barcoding strategi (se tabell av materialer) er de to mest brukte multipleksing metoder. Spesifikke strekkoder brukes til å merke hvert utvalg i begge metodene, og de merkede eksemplene blandes deretter for enkelt celle henting, biblioteks forberedelser og sekvenser. Etterpå kan de grupperte sekvensering dataene skilles ved å analysere strekkode sekvensene (figur 1)19. Det finnes imidlertid betydelige forskjeller mellom de to metodene. Den lipid basert barcoding strategien er basert på lipid-modifisert oligonukleotider, som ikke har blitt funnet å ha noen celle type preferanser. Mens antistoff-baserte barcoding-strategien bare kan oppdage cellene som uttrykker antigen-proteinene19,20. I tillegg tar det ca 10 min å flekk på lipider men 40 min å beis antistoffer (figur 1). Videre er lipid-modifiserte oligonukleotider billigere enn antistoff-bøyd oligonukleotider, men ikke kommersielt tilgjengelig på tidspunktet for å skrive denne artikkelen. Til slutt, lipid-basert strategi kan multiplex 96 prøver i ett eksperiment, men antistoff-basert strategi for tiden bare kan multiplex 12 prøver.
Det anbefalte celle nummeret for å multiplex i et enkelt eksperiment bør være lavere enn 2,5 x 104, ellers vil det føre til en høy andel av celle doublets og potensiell ambient mRNA-forurensning. Gjennom multipleksing strategier, kostnaden for enkelt celle fangst, cDNA generasjon, og biblioteket forberedelse for flere prøver vil bli redusert til kostnadene for en prøve, men sekvensering kostnadene vil forbli den samme.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne studien har vi demonstrert en protokoll for å analysere enkelt celle transcriptional profiler. Vi har også gitt to valgfrie metoder for å multiplex prøver i scRNA-SEQ arbeidsflyt. Begge metodene har vist seg å være gjennomførbart på ulike laboratorier og gitt løsninger for å kjøre en kostnadseffektiv og batch effekt-gratis enkelt celle eksperiment18,26.
Det er noen skritt som bør følges nøye når du går gjennom p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker David M. Patterson og Christopher S. McGinnis fra Dr. Zev J. Gartner Lab for deres type tilførsel av lipid baserte barcoding reagenser og forslag på eksperimentelle trinn og dataanalyse. Dette arbeidet ble grunnlagt av National Institutes of Health (HL13347202).
Materials
| 10% Tween-20 | Bio-Rad | 1610781 | |
| 10x Chip Holder | 10x Genomics | 120252 330019 | |
| 10x Chromium Controller | 10x Genomics | 120223 | |
| 10x Magnetic Separator | 10x Genomics | 120250 230003 | |
| 10x Vortex Adapter | 10x Genomics | 330002, 120251 | |
| 10x Vortex Clip | 10x Genomics | 120253 230002 | |
| 4200 TapeStation System | Agilent | G2991AA | |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | University of Pittsburgh Health Sciences Sequencing Core |
| Barcode Oligo | Integrated DNA Technologies | Single-stranded DNA | 25 nmol |
| Buffer EB | Qiagen | 19086 | |
| CD1 mice | Chales River | Strain Code 022 | ordered pregnant mice |
| Centrifuge 5424R | Appendorf | 2231000214 | |
| Chromium Chip B Single Cell Kit, 48 rxns | 10x Genomics | 1000073 | Store at ambient temperature |
| Chromium i7 Multiplex Kit, 96 rxns | 10x Genomics | 120262 | Store at -20 °C |
| Chromium Single Cell 3' GEM Kit v3,4 rxns | 10x Genomics | 1000094 | Store at -20 °C |
| Chromium Single Cell 3' Library Kit v3 | 10x Genomics | 1000095 | Store at -20 °C |
| Chromium Single Cell 3' v3 Gel Beads | 10x Genomics | 2000059 | Store at -80 °C |
| Collagenase A | Sigma/Millipore | 10103578001 | Store powder at 4 °C, store at -20 °C after it dissolves |
| Collagenase B | Sigma/Millipore | 11088807001 | Store powder at 4 °C, store at -20 °C after it dissolves |
| D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5582 | University of Pittsburgh Health Sciences Sequencing Core |
| DNA LoBind Tube Microcentrifuge Tube, 1.5 mL | Eppendorf | 022431021 | |
| DNA LoBind Tube Microcentrifuge Tube, 2.0 mL | Eppendorf | 022431048 | |
| Dynabeads MyOne SILANE | 10x Genomics | 2000048 | Store at 4 °C, used in Beads Cleanup Mix (Table 1) |
| DynaMag-2 Magnet | Theromo Scientific | 12321D | |
| Ethanol, Pure (200 Proof, anhydrous) | Sigma | E7023-500mL | |
| Falcon 15mL High Clarity PP Centrifuge Tube | Corning Cellgro | 14-959-70C | |
| Falcon 50mL High Clarity PP Centrifuge Tube | Corning Cellgro | 14-959-49A | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, United States | Fisher Scientific | 26140079 | Store at -20 °C |
| Finnpipette F1 Multichannel Pipettes, 10-100μl | Theromo Scientific | 4661020N | |
| Finnpipette F1 Multichannel Pipettes, 1-10μl | Theromo Scientific | 4661000N | |
| Flowmi Cell Strainer | Sigma | BAH136800040 | Porosity 40 μm, for 1000 uL Pipette Tips, pack of 50 each |
| Glycerin (Glycerol), 50% (v/v) | Ricca Chemical Company | 3290-32 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14170112 | |
| Human TruStain FcX (Fc Receptor Blocking Solution) | BioLegend | 422301 | Add 5 µl of Human TruStain FcX per million cells in 100 µl staining volume |
| Isopropanol (IPA) | Fisher Scientific | A464-4 | |
| Kapa HiFi HotStart ReadyMix (2X) | Fisher Scientific | NC0295239 | Store at -20 °C, used in Lipid-tagged barcode library mix (Table 1) |
| Lipid Barcode Primer (Multi-seq Primer) | Integrated DNA Technologies | Single-stranded DNA | 100 nmol |
| Low TE Buffer (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.1 mM EDTA) | Thermo Fisher Scientific | 12090-015 | |
| MasterCycler Pro | Eppendorf | 950W | |
| Nuclease-Free Water (Ambion) | Thermo Fisher Scientific | AM9937 | |
| PCR Tubes 0.2 ml 8-tube strips | Eppendorf | 951010022 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) 1X without calcium & magnesium | Corning Cellgro | 21-040-CV | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) with 10% Bovine Albumin (alternative to Thermo Fisher product) | Sigma-Aldrich | SRE0036 | |
| Pipet 4-pack (0.1–2.5μL, 0.5-10μL, 10–100μL, 100–1,000μL variable-volume pipettes | Fisher Scientific | 05-403-151 | |
| Selection reagent (SPRIselect Reagent Kit) | Beckman Coulter | B23318 (60ml) | |
| Template Switch Oligo | 10x Genomics | 3000228 | Store at -20 °C, used in Master Mix (Table 1) |
| The antibody based barcoding strategy is also known as Cell Hashing | |||
| The cell browser is Loup Cell Browser | 10x Genomics | https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/visualization/latest/what-is-loupe-cell-browser | |
| The commercial available analysis pipline in step 8.1 is Cell Ranger | 10x Genomics | https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/what-is-cell-ranger | |
| The lipid based barcoding strategy is also known as MULTI-seq | |||
| The well maintained R platform is Seurat V3 | satijalab | https://satijalab.org/seurat/ | |
| TipOne RPT 0.1-10/20 ul XL ultra low retention filter pipet tip | USA Scientific | 1180-3710 | |
| TipOne RPT 1000 ul XL ultra low retention filter pipet tip | USA Scientific | 1182-1730 | |
| TipOne RPT 200 ul ultra low retention filter pipet tip | USA Scientific | 1180-8710 | |
| TotalSeq-A0301 anti-mouse Hashtag 1 Antibody | BioLegend | 155801 | 0.1 – 1.0 µg of antibody in 100 µl of staining buffer for every 1 million cells |
| TotalSeq-A0302 anti-mouse Hashtag 2 Antibody | BioLegend | 155803 | 0.1 – 1.0 µg of antibody in 100 µl of staining buffer for every 1 million cells |
| TotalSeq-A0302 anti-mouse Hashtag 3 Antibody | BioLegend | 155805 | 0.1 – 1.0 µg of antibody in 100 µl of staining buffer for every 1 million cells |
| TrueSeq RPI primer | Integrated DNA Technologies | Single-stranded DNA | 100 nmol, used in Lipid-tagged barcode library mix (Table 1) |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Fisher Scientific | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Fisher Scientific | 25200-056 | |
| Universal I5 | Integrated DNA Technologies | Single-stranded DNA | 100 nmol |
References
- Raj, A., Van Den Bogaard, P., Rifkin, S. A., Van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nature Methods. 5 (10), 877 (2008).
- Tang, F., et al. mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell. Nature Methods. 6 (5), 377 (2009).
- Li, G., Plonowska, K., Kuppusamy, R., Sturzu, A., Wu, S. M. Identification of cardiovascular lineage descendants at single-cell resolution. Development. 142 (5), 846-857 (2015).
- DeLaughter, D. M., et al. Single-cell resolution of temporal gene expression during heart development. Developmental Cell. 39 (4), 480-490 (2016).
- Li, G., et al. Single cell expression analysis reveals anatomical and cell cycle-dependent transcriptional shifts during heart development. Development. 146 (12), dev173476 (2019).
- Meilhac, S. M., Buckingham, M. E. The deployment of cell lineages that form the mammalian heart. Nature Reviews Cardiology. 1, (2018).
- Liu, Z., et al. Single-cell transcriptomics reconstructs fate conversion from fibroblast to cardiomyocyte. Nature. 551 (7678), 100 (2017).
- Lafzi, A., Moutinho, C., Picelli, S., Heyn, H. Tutorial: guidelines for the experimental design of single-cell RNA sequencing studies. Nature Protocols. 1, (2018).
- The Tabula Muris Consortium. Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris. Nature. 562 (7727), 367 (2018).
- Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. Single-cell genome sequencing: current state of the science. Nature Reviews Genetics. 17 (3), 175 (2016).
- Grün, D., van Oudenaarden, A. Design and analysis of single-cell sequencing experiments. Cell. 163 (4), 799-810 (2015).
- Ziegenhain, C., et al. Comparative analysis of single-cell RNA sequencing methods. Molecular cell. 65 (4), 631-643 (2017).
- Hashimshony, T., et al. CEL-Seq2: sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq. Genome Biology. 17 (1), 77 (2016).
- Islam, S., et al. Characterization of the single-cell transcriptional landscape by highly multiplex RNA-seq. Genome Research. 21 (7), 1160-1167 (2011).
- Macosko, E. Z., et al. Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
- Klein, A. M., et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).
- . Library Prep -Single Cell Gene Expression -Official 10x Genomics Support Available from: https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/library-prep (2018)
- McGinnis, C. S., et al. MULTI-seq: sample multiplexing for single-cell RNA sequencing using lipid-tagged indices. Nature Methods. 1, (2019).
- Stoeckius, M., et al. Cell hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics. Genome Biology. 19 (1), 224 (2018).
- Chan, M. M., et al. Molecular recording of mammalian embryogenesis. Nature. 570 (7759), 77-82 (2019).
- . Agilent 4200 TapeStation System Available from: https://www.agilent.com/cs/library/datasheets/public/5991-6029EN.pdf (2019)
- . SPRIselect User Guide Available from: https://research.fhcrc.org/content/dam/stripe/hahn/methods/mol_biol/SPRIselect%20User%20Guide.pdf (2012)
- . Qubit 4 Fluorometer User Guide Available from: https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/MAN0017209_Qubit_4_Fluorometer_UG.pdf (2018)
- . Agilent High Sensitivity DNA Kit Guide Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/High%20Sensitivity_DNA_KG.pdf (2016)
- Butler, A., Hoffman, P., Smibert, P., Papalexi, E., Satija, R. Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species. Nature Biotechnology. 36 (5), 411 (2018).
- Weber, R. J., Liang, S. I., Selden, N. S., Desai, T. A., Gartner, Z. J. Efficient targeting of fatty-acid modified oligonucleotides to live cell membranes through stepwise assembly. Biomacromolecules. 15 (12), 4621-4626 (2014).
- . Single Cell Protocols Cell Preparation Guide Available from: https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sample-prep (2017)
