Multiplexerade Single cell mRNA sekvensering analys av mus embryonala celler
Summary
Här presenterade vi en multiplexade Single cell mRNA sekvenseringsmetod för att profilera genuttryck i mus embryonala vävnader. DROPP-baserade Single cell mRNA sekvensering (scRNA-SEQ) metod i kombination med Multiplexing strategier kan profilera enstaka celler från flera prover samtidigt, vilket avsevärt minskar reagenskostnader och minimerar experimentella batcheffekter.
Abstract
Single cell mRNA sekvensering har gjort betydande framsteg under de senaste åren och har blivit ett viktigt verktyg inom området utvecklingsbiologi. Det har framgångsrikt använts för att identifiera sällsynta cellpopulationer, upptäcka nya markörer gener, och avkoda rumsliga och temporala utvecklingsinformation. Den enda cell metoden har också utvecklats från mikroflödessystem baserad fluidigm C1-teknik till droplet-baserade lösningar under de senaste två till tre åren. Här använde vi hjärtat som ett exempel för att demonstrera hur man profilerar mus embryonala vävnadsceller med hjälp av DROPP-baserade scrna-SEQ-metoden. Dessutom har vi integrerat två strategier i arbetsflödet för att profilera flera exempel i ett enda experiment. Genom att använda en av de integrerade metoderna har vi samtidigt profilerat mer än 9 000 celler från åtta hjärtprover. Dessa metoder kommer att vara värdefulla för utvecklingsbiologin fältet genom att tillhandahålla ett kostnadseffektivt sätt att samtidigt profilera enstaka celler från olika genetiska bakgrunder, utvecklingsstadier, eller anatomiska platser.
Introduction
Den transkriptionella profilen för varje enskild cell varierar mellan cellpopulationer under embryonal utveckling. Även om enstaka molekylära in situ hybridisering kan användas för att visualisera uttrycket av ett litet antal gener1, Single cell mRNA sekvensering (scrna-SEQ) ger en opartisk metod för att illustrera genombrett uttryck mönster av gener i enskilda celler. Efter det publicerades först i 20092, scrna-SEQ har tillämpats för att studera flera vävnader på flera utvecklingsstadier under de senaste åren3,4,5. Dessutom, som Human cell Atlas har lanserat sina utvecklingsfokuserade projekt nyligen, mer enstaka celldata från mänskliga embryonala vävnader förväntas genereras inom en snar framtid.
Hjärtat som det första orgeln att utveckla spelar en avgörande roll i embryonal utveckling. Hjärtat består av flera celltyper och utvecklingen av varje celltyp är tätt reglerad temporally och rumsligt. Under de senaste åren, ursprung och cell härstamning av hjärtceller vid tidiga utvecklingsstadier har karakteriserats6, som ger en enorm användbar navigering verktyg för att förstå medfödda hjärtsjukdom patogenes, samt för att utveckla mer tekniskt avancerade metoder för att stimulera kardiomyocyte förnyelse7.
Scrna-SEQ har genomgått en snabb expansion de senaste åren8,9,10. Med de nyutvecklade metoderna har design och analys av enstaka cell experiment blivit mer uppnåeliga11,12,13,14. Den metod som presenteras här är ett kommersiellt förfarande baserat på dropp-lösningarna (se tabell över material)15,16. Denna metod har fånga celler och uppsättningar av unikt barkodade pärlor i en olja-vatten emulsion dropp under kontroll av ett mikroflödessystem Controller system. Hastigheten för cell lastning i dropparna är extremt låg så att majoriteten av DROPP emulsioner innehåller endast en cell17. Procedurets geniala design kommer från enkel cellseparation till dropp-emulsioner som inträffar samtidigt med barkodning, vilket möjliggör parallell analys av enskilda celler med hjälp av RNA-SEQ på en heterogen population.
Införlivandet av multiplexering strategier är en av de viktiga tillägg till den traditionella Single cell arbetsflöde13,14. Detta tillägg är mycket användbart i kassering cell doublets, minska experimentella kostnader, och eliminera parti effekter18,19. En lipid baserad streckkodning strategi och en antikropp baserad streckkodning strategi (se tabell över material) är de två mest använda Multiplexing metoder. Specifika streckkoder används för att märka varje prov i båda metoderna, och de märkta exemplen blandas sedan för enkel cell fångst, biblioteks förberedelse och sekvensering. Efteråt kan poolsekvensering data separeras genom att analysera streckkoden sekvenser (figur 1)19. Det finns dock betydande skillnader mellan de två metoderna. Den lipidbaserade streckkodning strategi bygger på lipid-modifierade oligonukleotides, som inte har visat sig ha någon celltyp preferenser. Medan antikropps baserade streckkodning strategi bara kan upptäcka de celler som uttrycker antigen proteiner19,20. Dessutom tar det ca 10 min att färga lipider men 40 min att färga antikropparna (figur 1). Dessutom är de lipidmodifierade oligonukleotiderna billigare än antikroppskonjugerade oligonukleotider, men inte kommersiellt tillgängliga vid skrivande stund i denna artikel. Slutligen kan den lipidbaserade strategin multiplex 96 prover i ett experiment, men den antikroppsbaserade strategi för närvarande kan bara multiplex 12 prover.
Den rekommenderade cell nummer till multiplex i ett enda experiment bör vara lägre än 2,5 x 104, annars, det kommer att leda till en hög andel av cell dubletter och potentiell omgivande mRNA förorening. Genom multiplexering strategier, kostnaden för Single cell fånga, cDNA generation, och bibliotek förberedelse för flera prover kommer att reduceras till kostnaden för ett prov men sekvenserings kostnaden kommer att förbli densamma.
Protocol
Representative Results
Discussion
I den här studien har vi visat ett protokoll för att analysera transkriptionella profiler för enskilda celler. Vi har också tillhandahållit två valfria metoder för att multiplex prover i scRNA-SEQ arbetsflöde. Båda metoderna har visat sig vara genomförbara på olika laboratorier och tillhandahållit lösningar för att driva en kostnadseffektiv och satsvis effekt-fri enda cell experiment18,26.
Det finns några steg som bör f…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar David M. Patterson och Christopher S. McGinnis från Dr. Zev J. Gartner Lab för deras vänliga försörjning av lipidbaserade streckkodning reagenser och förslag på experimentella steg och dataanalys. Detta arbete grundades av National Institutes of Health (HL13347202).
Materials
| 10% Tween-20 | Bio-Rad | 1610781 | |
| 10x Chip Holder | 10x Genomics | 120252 330019 | |
| 10x Chromium Controller | 10x Genomics | 120223 | |
| 10x Magnetic Separator | 10x Genomics | 120250 230003 | |
| 10x Vortex Adapter | 10x Genomics | 330002, 120251 | |
| 10x Vortex Clip | 10x Genomics | 120253 230002 | |
| 4200 TapeStation System | Agilent | G2991AA | |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | University of Pittsburgh Health Sciences Sequencing Core |
| Barcode Oligo | Integrated DNA Technologies | Single-stranded DNA | 25 nmol |
| Buffer EB | Qiagen | 19086 | |
| CD1 mice | Chales River | Strain Code 022 | ordered pregnant mice |
| Centrifuge 5424R | Appendorf | 2231000214 | |
| Chromium Chip B Single Cell Kit, 48 rxns | 10x Genomics | 1000073 | Store at ambient temperature |
| Chromium i7 Multiplex Kit, 96 rxns | 10x Genomics | 120262 | Store at -20 °C |
| Chromium Single Cell 3' GEM Kit v3,4 rxns | 10x Genomics | 1000094 | Store at -20 °C |
| Chromium Single Cell 3' Library Kit v3 | 10x Genomics | 1000095 | Store at -20 °C |
| Chromium Single Cell 3' v3 Gel Beads | 10x Genomics | 2000059 | Store at -80 °C |
| Collagenase A | Sigma/Millipore | 10103578001 | Store powder at 4 °C, store at -20 °C after it dissolves |
| Collagenase B | Sigma/Millipore | 11088807001 | Store powder at 4 °C, store at -20 °C after it dissolves |
| D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5582 | University of Pittsburgh Health Sciences Sequencing Core |
| DNA LoBind Tube Microcentrifuge Tube, 1.5 mL | Eppendorf | 022431021 | |
| DNA LoBind Tube Microcentrifuge Tube, 2.0 mL | Eppendorf | 022431048 | |
| Dynabeads MyOne SILANE | 10x Genomics | 2000048 | Store at 4 °C, used in Beads Cleanup Mix (Table 1) |
| DynaMag-2 Magnet | Theromo Scientific | 12321D | |
| Ethanol, Pure (200 Proof, anhydrous) | Sigma | E7023-500mL | |
| Falcon 15mL High Clarity PP Centrifuge Tube | Corning Cellgro | 14-959-70C | |
| Falcon 50mL High Clarity PP Centrifuge Tube | Corning Cellgro | 14-959-49A | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, United States | Fisher Scientific | 26140079 | Store at -20 °C |
| Finnpipette F1 Multichannel Pipettes, 10-100μl | Theromo Scientific | 4661020N | |
| Finnpipette F1 Multichannel Pipettes, 1-10μl | Theromo Scientific | 4661000N | |
| Flowmi Cell Strainer | Sigma | BAH136800040 | Porosity 40 μm, for 1000 uL Pipette Tips, pack of 50 each |
| Glycerin (Glycerol), 50% (v/v) | Ricca Chemical Company | 3290-32 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14170112 | |
| Human TruStain FcX (Fc Receptor Blocking Solution) | BioLegend | 422301 | Add 5 µl of Human TruStain FcX per million cells in 100 µl staining volume |
| Isopropanol (IPA) | Fisher Scientific | A464-4 | |
| Kapa HiFi HotStart ReadyMix (2X) | Fisher Scientific | NC0295239 | Store at -20 °C, used in Lipid-tagged barcode library mix (Table 1) |
| Lipid Barcode Primer (Multi-seq Primer) | Integrated DNA Technologies | Single-stranded DNA | 100 nmol |
| Low TE Buffer (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.1 mM EDTA) | Thermo Fisher Scientific | 12090-015 | |
| MasterCycler Pro | Eppendorf | 950W | |
| Nuclease-Free Water (Ambion) | Thermo Fisher Scientific | AM9937 | |
| PCR Tubes 0.2 ml 8-tube strips | Eppendorf | 951010022 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) 1X without calcium & magnesium | Corning Cellgro | 21-040-CV | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) with 10% Bovine Albumin (alternative to Thermo Fisher product) | Sigma-Aldrich | SRE0036 | |
| Pipet 4-pack (0.1–2.5μL, 0.5-10μL, 10–100μL, 100–1,000μL variable-volume pipettes | Fisher Scientific | 05-403-151 | |
| Selection reagent (SPRIselect Reagent Kit) | Beckman Coulter | B23318 (60ml) | |
| Template Switch Oligo | 10x Genomics | 3000228 | Store at -20 °C, used in Master Mix (Table 1) |
| The antibody based barcoding strategy is also known as Cell Hashing | |||
| The cell browser is Loup Cell Browser | 10x Genomics | https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/visualization/latest/what-is-loupe-cell-browser | |
| The commercial available analysis pipline in step 8.1 is Cell Ranger | 10x Genomics | https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/what-is-cell-ranger | |
| The lipid based barcoding strategy is also known as MULTI-seq | |||
| The well maintained R platform is Seurat V3 | satijalab | https://satijalab.org/seurat/ | |
| TipOne RPT 0.1-10/20 ul XL ultra low retention filter pipet tip | USA Scientific | 1180-3710 | |
| TipOne RPT 1000 ul XL ultra low retention filter pipet tip | USA Scientific | 1182-1730 | |
| TipOne RPT 200 ul ultra low retention filter pipet tip | USA Scientific | 1180-8710 | |
| TotalSeq-A0301 anti-mouse Hashtag 1 Antibody | BioLegend | 155801 | 0.1 – 1.0 µg of antibody in 100 µl of staining buffer for every 1 million cells |
| TotalSeq-A0302 anti-mouse Hashtag 2 Antibody | BioLegend | 155803 | 0.1 – 1.0 µg of antibody in 100 µl of staining buffer for every 1 million cells |
| TotalSeq-A0302 anti-mouse Hashtag 3 Antibody | BioLegend | 155805 | 0.1 – 1.0 µg of antibody in 100 µl of staining buffer for every 1 million cells |
| TrueSeq RPI primer | Integrated DNA Technologies | Single-stranded DNA | 100 nmol, used in Lipid-tagged barcode library mix (Table 1) |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Fisher Scientific | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Fisher Scientific | 25200-056 | |
| Universal I5 | Integrated DNA Technologies | Single-stranded DNA | 100 nmol |
References
- Raj, A., Van Den Bogaard, P., Rifkin, S. A., Van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nature Methods. 5 (10), 877 (2008).
- Tang, F., et al. mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell. Nature Methods. 6 (5), 377 (2009).
- Li, G., Plonowska, K., Kuppusamy, R., Sturzu, A., Wu, S. M. Identification of cardiovascular lineage descendants at single-cell resolution. Development. 142 (5), 846-857 (2015).
- DeLaughter, D. M., et al. Single-cell resolution of temporal gene expression during heart development. Developmental Cell. 39 (4), 480-490 (2016).
- Li, G., et al. Single cell expression analysis reveals anatomical and cell cycle-dependent transcriptional shifts during heart development. Development. 146 (12), dev173476 (2019).
- Meilhac, S. M., Buckingham, M. E. The deployment of cell lineages that form the mammalian heart. Nature Reviews Cardiology. 1, (2018).
- Liu, Z., et al. Single-cell transcriptomics reconstructs fate conversion from fibroblast to cardiomyocyte. Nature. 551 (7678), 100 (2017).
- Lafzi, A., Moutinho, C., Picelli, S., Heyn, H. Tutorial: guidelines for the experimental design of single-cell RNA sequencing studies. Nature Protocols. 1, (2018).
- The Tabula Muris Consortium. Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris. Nature. 562 (7727), 367 (2018).
- Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. Single-cell genome sequencing: current state of the science. Nature Reviews Genetics. 17 (3), 175 (2016).
- Grün, D., van Oudenaarden, A. Design and analysis of single-cell sequencing experiments. Cell. 163 (4), 799-810 (2015).
- Ziegenhain, C., et al. Comparative analysis of single-cell RNA sequencing methods. Molecular cell. 65 (4), 631-643 (2017).
- Hashimshony, T., et al. CEL-Seq2: sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq. Genome Biology. 17 (1), 77 (2016).
- Islam, S., et al. Characterization of the single-cell transcriptional landscape by highly multiplex RNA-seq. Genome Research. 21 (7), 1160-1167 (2011).
- Macosko, E. Z., et al. Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
- Klein, A. M., et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).
- . Library Prep -Single Cell Gene Expression -Official 10x Genomics Support Available from: https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/library-prep (2018)
- McGinnis, C. S., et al. MULTI-seq: sample multiplexing for single-cell RNA sequencing using lipid-tagged indices. Nature Methods. 1, (2019).
- Stoeckius, M., et al. Cell hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics. Genome Biology. 19 (1), 224 (2018).
- Chan, M. M., et al. Molecular recording of mammalian embryogenesis. Nature. 570 (7759), 77-82 (2019).
- . Agilent 4200 TapeStation System Available from: https://www.agilent.com/cs/library/datasheets/public/5991-6029EN.pdf (2019)
- . SPRIselect User Guide Available from: https://research.fhcrc.org/content/dam/stripe/hahn/methods/mol_biol/SPRIselect%20User%20Guide.pdf (2012)
- . Qubit 4 Fluorometer User Guide Available from: https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/MAN0017209_Qubit_4_Fluorometer_UG.pdf (2018)
- . Agilent High Sensitivity DNA Kit Guide Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/High%20Sensitivity_DNA_KG.pdf (2016)
- Butler, A., Hoffman, P., Smibert, P., Papalexi, E., Satija, R. Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species. Nature Biotechnology. 36 (5), 411 (2018).
- Weber, R. J., Liang, S. I., Selden, N. S., Desai, T. A., Gartner, Z. J. Efficient targeting of fatty-acid modified oligonucleotides to live cell membranes through stepwise assembly. Biomacromolecules. 15 (12), 4621-4626 (2014).
- . Single Cell Protocols Cell Preparation Guide Available from: https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sample-prep (2017)
