שימוש בקרום כוראלאלי ממברנה במודל Vivo כדי ללמוד גינקולוגית ואורולוגיים סרטן
Summary
אנו מציגים את המודל ממברנה העוף כוראואליאלי כחלופה, השתלה שולחן, במודל vivo עבור החרט של גינקולוגית ואורולוגית תאים לסרטן וגידולים הנגזר החולה.
Abstract
מודלים עכבר הם בדיקות בחינת ביצועים עבור בלימודי סרטן vivo. עם זאת, עלות, זמן, שיקולים אתית הובילו שיחות חלופיות לvivo מודלים סרטניים. הקרום כוראלאלי ממברנה (CAM) המודל מספק חלופה זולה, מהירה המאפשרת ויזואליזציה ישירה של פיתוח הגידול מתאים הדמיה vivo. ככזה, ביקשו לפתח פרוטוקול מיטבי לחרט גינקולוגית ולהפוך גידולים אורולוגיים למודל זה, אשר אנו מציגים כאן. כ 7 ימים הפריה, תא האוויר מועבר לצד הvascularized של הביצה, שם נוצר פתח במעטפת. גידולים ממורין וקווי התאים האנושיים רקמות ראשיות ניתן לאחר מכן מצטלבים. אלה הם בדרך כלל שנזרע תערובת של מטריקס ובינוניות ובינוניים כדי למנוע פיזור הסלולר ולספק תמיכה מזינים עד התאים לגייס אספקת כלי דם. גידולים עשויים לצמוח לאחר מכן עד 14 ימים נוספים לפני בקיעה ביצה. על ידי שתילת תאים באופן בלתי נשכח עם גחלילית לוציפראז, הדמיה ביולומינסנציה יכול לשמש לאיתור רגיש של גידול בקרום והסרטן להתפשט לאורך העובר. מודל זה יכול לשמש לחקר הטווריגניות, פלישה, גרורות, ויעילות טיפולית. מודל מצלמת עוף דורש פחות זמן ומשאבים פיננסיים בהשוואה למודלים murine מסורתיים. מכיוון שהביצים הן בעיות חיסוני ועמידות חיסונית, רקמות מכל אורגניזם יכול להיות מושתל ללא בעלי חיים הטרנסגניים יקרים (למשל, עכברים) נדרש עבור השרשה של רקמות האדם. עם זאת, רבים מהיתרונות של מודל זה יכול להיות גם מגבלות, כולל את זמן הגידול הקצר הדור החיסוני/החיסונית המצב העמידות. בנוסף, למרות כל סוגי הגידולים המוצגים כאן בתוך מודל הקרום כוראלאלי העוף ממברנה, הם עושים זאת עם דרגות שונות של צמיחת הגידול.
Introduction
עכברים שימשו כאורגניזם מודל קלאסי לחקר מחלות אנוש, כולל ממאירות. כיונקים, הם חולקים. דמיון רב לבני אדם רמה גבוהה שלהם של דמיון גנטי אפשרה מניפולציה הטרנסגניים של הגנום העכבר כדי לספק תובנה עצומה לתוך השליטה הגנטית של מחלות האדם1. ניסיון רב בטיפול של וניסויים עם עכברים הביא להיות מודל הבחירה למחקר ביו רפואי. עם זאת, בנוסף חששות מוסרית ומדעית לגבי דגמי murine, הם יכולים גם להיות יקרים למדי זמן רב2,3. התפתחות של גידולים יכול לקחת שבועות או אפילו חודשים. הדיור במוסד אופייני בלבד יכול לרוץ במאות עד אלפי דולרים בעוד גידולים מתפתחים. סרטן השחלות הוא דוגמה של חיסרון זה משום הצמיחה שלה במודלים murine יכול בקלות לקחת חודשים. עיכובים התקדמות מחקר פוטנציאלי להשפיע על סרטן השחלות חולים ‘ בהתמדה נמוכה הישרדות שיעור 5 שנים של רק 47% (כלומר, עלייה בהישרדות של רק 10% מעל 30 שנים)4. באופן דומה, סרטן אורולוגי (כליות, ערמונית, וסרטן שלפוחית השתן) מהווים 19% של כל המקרים הסרטניים בארצות הברית ו -11% של מקרי מוות הקשורים לסרטן4. כך, רומן בגישה vivo ללמוד סרטן גינקולוגית ואורולוגיים יכול להציל מעבדה משמעותית זמן, עבודה, וכסף, גם אם מודל זה מיושם רק ניסויים הראשונית ההקרנה. בנוסף, ההאצה המתקבלת של ממצאי מחקר יכול להשפיע באופן משמעותי על 177,000 אנשים שאובחנו עם סרטן אלה מדי שנה.
מודל CAM עוף מציע יתרונות רבים הנוגעים בסוגיות הנ ל. מודל פופולרי כדי ללמוד אנגיוגנזה5,6, הפלישה תא הגידול7,8, גרורות7,9, מודל העובר אפרוח מצלמת כבר שימש ללמוד צורות רבות של סרטן, כולל glioma10,11,12, הראש והצוואר קרצינומה של תאים13,14, לוקמיה15,16, סרטן הלבלב17, ו סרטן המעי הגס18. בנוסף, מודלים קאם נוצרו עבור נוירובלסטומה19, לימפומה בורקיט20, מלנומה21, וחתולים פיברוסרקומה22. מחקרים קודמים הציגו גם חרט סרטן שלפוחית השתן23 ו סרטן הערמונית קווי התאים24, אבל עם פרטי פרוטוקול מוגבל. לא רק שהביצים זולות בהרבה מעכברים, אבל הן גם מפיקות תוצאות מאוד מובנות25,26. הם מראים פיתוח מהיר של ואסילטורה, והתפתחות הגידול יכולה להתרחש מהר ככל כמה ימים ולהיות דמיינו longitudinally דרך החלון הפתוח. עם מסגרת הזמן 21 יום בין הפריה ביצה הבקיעה, ניסויים ניתן להשלים בתוך כמה שבועות. יתרה מזאת, העלות הנמוכה, צורכי הדיור המוגבלים, וגודל קטן מאפשרים בקלות ניסויים בקנה מידה גדול שיהיה מיועד ללימודי העכבר.
לכן, ביקשו למטב את מודל CAM עבור החרט של גינקולוגית ואורולוגית סרטן. בשל המצב החיסוני של העובר הקודם עוף27, שני העכבר ואת התאים האנושיים יכול להיות מושתל בקלות. ככזה, יש לנו בהצלחה לחרט מנופה השחלות, כליות, ערמונית, וסרטן שלפוחית השתן. עבור כל אחד מסוגי הגידולים האלה, מצלמת בקלות מקבל הוקמה murine ו/או האדם תאים הגידול קווי. חשוב מכך, שנקטפו טרי רקמות הגידול האנושי העיקרי יכול גם לעבור מתוך תאים מתעכל או פיסות של רקמה מוצקה עם שיעור גבוה של הצלחה. כל אחד מסוגי הסרטן האלה ומקורות התא דורש אופטימיזציה, אשר אנו חולקים כאן.
Protocol
Representative Results
Discussion
הרחבת הגידול וחרט באמצעות מודל מצלמת ההיתרים מהירה יותר הנצפה ישירות הגידול מאשר קיים בדגמי בעלי חיים vivo. בנוסף, עלויות הן נמוכות באופן משמעותי לאחר הרכישה הראשונית של ציוד הושלם, במיוחד כאשר בהשוואה לעלות של עכברים הפרוצים החיסונית. המצב הראשוני והחיסוני של עוברי העוף מתיר בקלות את מצבה …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצים להודות לד ר פויוקו טאנוק ובין וו להכשרה הראשונית בשיטה זו. שיחות עם ד ר אווה Koziolek היו אינסטרומנטלי באופטימיזציה גישה זו והיה מוערך מאוד. עבודה זו לא היה אפשרי ללא מימון מן המקורות הבאים: מחקר טבק הקשורים לתוכנית המחקר פוסט דוקטורט (27FT-0023, כדי ACS), מחלקת ההגנה (משרד ההגנה) סרטן השחלות תוכנית המחקר (W81XWH-17-1-0160), NCI/NIH (1R21CA216770), מחקר הקשורות לטבק תוכנית פיילוט השפעה גבוהה טייס (27FT-0016), ואת התמיכה המוסדית UCLA, כולל מענק הזרע JCCC (NCI/NIH P30CA016042) ו-3R מענק מהמשרד של סגן הקנצלר למחקר LW.
Materials
| -010 Teflon (PTFE) White 55 Duro Shore D O-Rings | The O-Ring Store | TEF010 | Nonstick ring for cell seeding. 1/4"ID X 3/8"OD X 1/16"CS Polytetrafluoroethylene (PTFE). |
| C4-2 | ATCC | CRL-3314 | Human prostate cancer cell line. |
| CWR22Rv1 | CWR cells were the kind gift of Dr. David Agus (Keck Medicine of University of Southern California) | ||
| Cytokeratin 8/18 Antibody (C-51) | Novus Biologicals | NBP2-44929-0.02mg | Used at a dilution of 1:100 for immunohistochemical analysis of human ovarian CAM tumors. |
| D-Luciferin Firefly, potassium salt | Goldbio | LUCK-1G | |
| Delicate Operating Scissors; Curved; Sharp-Sharp; 30mm Blade Length; 4-3/4 in. Overall Length | Roboz Surgical | RS6703 | This is provided as an example. Any similar curved scissors would work as well. |
| Dremel 8050-N/18 Micro 8V Max Tool Kit | Dremel | 8050-N/18 | This kit contains all necessary tools. |
| Fertilized chicken eggs (Rhode Island Red – Brown, Lab Grade) | AA Lab Eggs Inc. | N/A | A local egg supplier would need to be identified, as this supplier only delivers regionally. |
| HT-1376 | ATCC | CRL-1472 | Human bladder cancer cell line. |
| Hovabator Genesis 1588 Deluxe Egg Incubator Combo Kit | Incubator Warehouse | HB1588D-NONE-1102-1588-1357 | Other egg incubators may be used, but their reliability would need to be verified. After implantation, a cell incubator with the CO2 disabled may also be used. |
| ID8 | Not commercially available, please see PMID: 10753190. | ||
| Incu-Bright Cool Light Egg Candler | Incubator Warehouse | 1102 | Other candlers may be used; however, this is preferred among those that we have tested. This candler is included in the aforementioned incubator kit. |
| Iris Forceps, 10cm, Curved, Serrated, 0.8mm tips | World Precision Instrument | 15915 | This is provided as an example. Any similar curved forceps would work as well. Multiple brands have been used for this method. |
| Isoflurane | Clipper Distributing | 0010250 | |
| IVIS Lumina II In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | ||
| Matrigel Membrane Matrix HC; LDEV-Free | Corning | 354248 | Extracellular matrix solution |
| MyC-CaP | ATCC | CRL-3255 | Murine prostate cancer cell line. |
| Portable Pipet-Aid XP Pipette Controller | Drummond Scientific | 4-000-101 | Any similar pipet controller would be appropriate. |
| PrecisionGlide Hypodermic Needles | BD | 305196 | This is provided as an example. Any 18G needle would work similarly. |
| RENCA | ATCC | CRL-2947 | |
| Semken Forceps | Fine Science Tools | 11008-13 | This is provided as an example. Any similar forceps or another style that suits researcher preference would be appropriate. |
| SKOV3 | ATCC | HTB-77 | Human ovarian cancer cell line. |
| Specimen forceps | Electron Microscopy Sciences | 72914 | This is provided as an example. The forceps used for pulling away the shell for bioluminescence imaging are approximately 12.8 cm long with 3 mm-wide tips. |
| Sterile Cotton Balls | Fisherbrand | 22-456-885 | This is provided as an example. Any sterile cotton balls would suffice. |
| Stirring Rods with Rubber Policeman; 5mm diameter, 6 in. length | United Scientific Supplies | GRPL06 | This is provided as an example. Any similar glass stir rods would work as well. |
| T24 | ATCC | HTB-4 | Human bladder cancer cell line. |
| Tegaderm Transparent Dressing Original Frame Style 2 3/8" x 2 3/4" | Moore Medical | 21272 | |
| Tissue Culture Dishes, 10 cm diameter | Corning | 353803 | This is provided as an example. Any similar, sterile 10-cm dish may be used. Tissue culture treatment is not necessary. |
| Tygon Clear Laboratory Tubing – 1/4 x 3/8 x 1/16 wall (50 feet) | Tygon | AACUN017 | This is provided as an example. Any similarly sized tubing would work as well. |
References
- Kersten, K., de Visser, K. E., van Miltenburg, M. H., Jonkers, J. Genetically engineered mouse models in oncology research and cancer medicine. EMBO Molecular Medicine. 9 (2), 137-153 (2017).
- Jackson, S. J., Thomas, G. J. Human tissue models in cancer research: looking beyond the mouse. Disease Models & Mechanisms. 10 (8), 939-942 (2017).
- Cheon, D. J., Orsulic, S. Mouse Models of Cancer. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 6 (1), 95-119 (2011).
- . SEER Cancer Statistics Review, 1975-2016 Available from: https://seer.cancer.gov/csr/1975_2016/ (2018)
- Ribatti, D. Chicken chorioallantoic membrane angiogenesis model. Methods Molecular Biology. 843, 47-57 (2012).
- Nowak-Sliwinska, P., Segura, T., Iruela-Arispe, M. L. The chicken chorioallantoic membrane model in biology, medicine and bioengineering. Angiogenesis. 17 (4), 779-804 (2014).
- Lokman, N. A., Elder, A. S., Ricciardelli, C., Oehler, M. K. Chick chorioallantoic membrane (CAM) assay as an in vivo model to study the effect of newly identified molecules on ovarian cancer invasion and metastasis. International Journal of Molecular Science. 13 (8), 9959-9970 (2012).
- Xiao, X., et al. Chick Chorioallantoic Membrane Assay: A 3D Animal Model for Study of Human Nasopharyngeal Carcinoma. PLoS ONE. 10 (6), e0130935 (2015).
- Deryugina, E. I., Quigley, J. P. Chick embryo chorioallantoic membrane model systems to study and visualize human tumor cell metastasis. Histochemistry and Cell Biology. 130 (6), 1119-1130 (2008).
- Shoin, K., et al. Chick Embryo Assay as Chemosensitivity Test for Malignant Glioma. Japanese Journal of Cancer Research. 82 (10), 1165-1170 (1991).
- Hagedorn, M., et al. Accessing key steps of human tumor progression in vivo by using an avian embryo model. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 102 (5), 1643-1648 (2005).
- Kavaliauskaitė, D., et al. The Effect of Sodium Valproate on the Glioblastoma U87 Cell Line Tumor Development on the Chicken Embryo Chorioallantoic Membrane and on EZH2 and p53 Expression. BioMed Research International. 2017, 12 (2017).
- Liu, M., et al. The Histone Methyltransferase EZH2 Mediates Tumor Progression on the Chick Chorioallantoic Membrane Assay, a Novel Model of Head and Neck Squamous Cell Carcinoma. Translational Oncology. 6 (3), 273-281 (2013).
- Rudy, S. F., et al. In vivo Wnt pathway inhibition of human squamous cell carcinoma growth and metastasis in the chick chorioallantoic model. Journal of Otolaryngology – Head & Neck Surgery. 45 (1), 26 (2016).
- Canale, S., et al. Interleukin-27 inhibits pediatric B-acute lymphoblastic leukemia cell spreading in a preclinical model. Leukemia. 25, 1815 (2011).
- Loos, C., et al. Amino-functionalized nanoparticles as inhibitors of mTOR and inducers of cell cycle arrest in leukemia cells. Biomaterials. 35 (6), 1944-1953 (2014).
- Rovithi, M., et al. Development of bioluminescent chick chorioallantoic membrane (CAM) models for primary pancreatic cancer cells: a platform for drug testing. Scientific Reports. 7, 44686 (2017).
- Majerník, M., et al. Novel Insights into the Effect of Hyperforin and Photodynamic Therapy with Hypericin on Chosen Angiogenic Factors in Colorectal Micro-Tumors Created on Chorioallantoic Membrane. International Journal of Molecular Science. 20 (12), 3004 (2019).
- Swadi, R., et al. Optimising the chick chorioallantoic membrane xenograft model of neuroblastoma for drug delivery. BMC Cancer. 18 (1), 28 (2018).
- Klingenberg, M., Becker, J., Eberth, S., Kube, D., Wilting, J. The chick chorioallantoic membrane as an in vivo xenograft model for Burkitt lymphoma. BMC Cancer. 14 (1), 339 (2014).
- Avram, S., et al. Standardization of A375 human melanoma models on chicken embryo chorioallantoic membrane and Balb/c nude mice. Oncology Reports. 38 (1), 89-99 (2017).
- Zabielska-Koczywas, K., et al. 3D chick embryo chorioallantoic membrane model as an in vivo model to study morphological and histopathological features of feline fibrosarcomas. BMC Veterinary Research. 13 (1), 201 (2017).
- Skowron, M. A., et al. Applying the chicken embryo chorioallantoic membrane assay to study treatment approaches in urothelial carcinoma. Urologic Oncology: Seminars and Original Investigations. 35 (9), e511-e523 (2017).
- Jefferies, B., et al. Non-invasive imaging of engineered human tumors in the living chicken embryo. Scientific Reports. 7 (1), 4991 (2017).
- Taizi, M., Deutsch, V. R., Leitner, A., Ohana, A., Goldstein, R. S. A novel and rapid in vivo system for testing therapeutics on human leukemias. Experimental Hematology. 34 (12), 1698-1708 (2006).
- Strojnik, T., Kavalar, R., Barone, T. A., Plunkett, R. J. Experimental model and immunohistochemical comparison of U87 human glioblastoma cell xenografts on the chicken chorioallantoic membrane and in rat brains. Anticancer Research. 30 (12), 4851-4860 (2010).
- Ribatti, D. The chick embryo chorioallantoic membrane as a model for tumor biology. Experimental Cell Research. 328 (2), 314-324 (2014).
- Hu, J., et al. A Non-integrating Lentiviral Approach Overcomes Cas9-Induced Immune Rejection to Establish an Immunocompetent Metastatic Renal Cancer Model. Molecular Therapy – Methods & Clinical Development. 9, 203-210 (2018).
