スプリットルシフェラーゼアッセイ系を用いたHBx-DDB1相互作用の同定阻害剤
Summary
ここでは、スプリットルシフェラーゼアッセイ系を用いてHBx-DDB1相互作用を阻害する抗肝炎ウイルス剤をスクリーニングする方法を提示する。このシステムはタンパク質間相互作用の容易な検出を可能にし、そのような相互作用の阻害剤を同定するのに適している。
Abstract
B型肝炎ウイルス(HBV)感染に対する新しい治療薬が緊急に必要である。現在利用可能なnucleos(t)ideアナログはウイルス複製を強力に阻害しますが、ウイルス共有閉じた円形DNA(cccDNA)から転写されたウイルスタンパク質の発現に直接影響はありません。高いウイルス抗原負荷は、この慢性およびHBV関連発癌の役割を果たし得るとして、HBV治療の目的は、ウイルスタンパク質を根絶することである。HBV調節タンパク質X(HBx)は、クロムソーム5/6(Smc5/6)の構造維持を分解するために宿主DNA損傷結合タンパク質1(DDB1)タンパク質に結合し、cccDNAからのウイルス転写の活性化をもたらす。ここでは、スプリットルシフェラーゼ補体アッセイシステムを用いて、HBx-DDB1相互作用の阻害剤を同定する包括的な化合物スクリーニングシステムを提示する。当社のプロトコルは、生細胞内の相互作用ダイナミクスをリアルタイムで簡単に検出できるようにします。この技術は、HBV感染の治療のための新しい治療薬を発見するための重要なアッセイとなり得る。
Introduction
B型肝炎ウイルス(HBV)感染は世界的に大きな公衆衛生上の懸念事項であり、年間推定では2億4,000万人がHBVに慢性的に感染し、肝硬変や肝細胞癌(HCC)1を含む感染症による合併症による死亡が9万人にのぼります。現在の抗HBV治療薬である核(t)ideアナログは、ウイルス逆転写を十分に阻害するが、長期的な臨床目標であるウイルスタンパク質の排除を達成することはめったにない。ウイルスタンパク質除去に対する彼らの悪い効果は、肝細胞核2におけるエピソームウイルス共有閉環DNA(cccDNA)ミニクロモソームからのウイルス転写に対する直接的な影響の欠如によるものである。
HBV転写は、HBV調節X(HBx)タンパク質3によって活性化される。最近の研究では、HBxがDDB1-CUL4-ROC1 E3ユビキチンリガーゼ複合体4、5、6をハイジャックすることによって、cccDNAからのHBV転写をブロックする宿主制限因子である染色体5/6(Smc5/6)の構造維持を低下させることが明らかになった。したがって、cccDNAからのウイルス転写を促進する上で重要なステップは、HBx-DDB1相互作用であると考えられている。HBxとDDB1との結合を阻害し得る化合物は、ウイルス転写を遮断し得るが、実際にニタゾキサニドは、当研究室7で開発されたスクリーニングシステムを介したHBx-DDB1相互作用の阻害剤として同定された。
ここでは、分割ルシフェラーゼ相補アッセイ7、8を利用したHBx-DDB1相互作用の阻害剤を同定するために用いられる便利なスクリーニングシステムを提示する。スプリットルシフェラーゼサブユニットはHBxおよびDDB1に融合され、HBx-DDB1相互作用はサブユニットを近接させ、明るい発光シグナルを生成する機能的酵素を形成します。サブユニット間の相互作用は可逆的であるため、このシステムはHBx-DDB1タンパク質の急速な解離を検出することができます(図1)。このシステムを使用すると、大きな化合物ライブラリーを容易にスクリーニングすることができ、HBx-DDB1相互作用を効率的に阻害し得る新規化合物の発見をもたらす可能性がある。
Protocol
Representative Results
Discussion
HBx-DDB1結合阻害剤を見つけるためにスプリットルシフェラーゼアッセイを用いた便利なスクリーニング方法を開発した。相互作用ダイナミクスは、細胞リシスを必要とせずに生細胞内でリアルタイムに検出することができる。HBx-DDB1相互作用の阻害は、Smc5/6の回復をもたらし、ウイルス転写、タンパク質発現、およびcccDNA産生の抑制をもたらす7。抗ウイルス作用のこの新し?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、文部科学省の助成金によって支えられ、 スポーツ・サイエンス・テクノロジー,#19J11829 #19H03430 日本のスポーツ・科学・#17K09405,・#17K09405,革新的分野科学研究助成(#18H05024~M.O.)による日本医学 #JP19fk021005研究開発機構の肝炎研究プログラムによる、B型肝炎の革新的開発と新薬の応用に関するプログラムによる革新的開発・新薬の応用に関するプログラムによる革新的な開発・#JP19fk0310102国際交流基金、小林がん研究財団(M.O.)、GSKジャパン研究助成2018(株式会社)、宮川記念研究財団(代表)の助成を受けています。
Materials
| Cell culture microplate, 96 well, PS, F-BOTTOM | Greiner-Bio-One GmbH | 655098 | |
| DMEM | Sigma Aldrich | D6046 | |
| DMSO | Tocris Bioscience | 3176 | |
| Effectene transfection reagent | Qiagen | 301425 | Includes DNA-condensation buffer, enhancer solution and transfection reagent |
| FBS | Nichirei | 175012 | |
| GloMax 96 microplate luminometer | Promega | E6521 | |
| HBx–LgBit expressing DNA plasmid | Our laboratory | Available upon request | |
| HEK293T cells | American Type Culture Collection | CRL-11268 | |
| NanoBiT PPI starter systems | Promega | N2015 | Includes Nano-Glo Live Cell Reagent |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 11058021 | Described as "buffered cell culture medium" in the manuscript |
| PBS | Takara | T900 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P0781 | |
| Screen-Well FDA-approved drug library V2 version 1.0 | Enzo Life Sciences | BML-2841 | Compounds used here were as follows: mequinol, mercaptopurine hydrate, mesna, mestranol, metaproterenol hemisulfate, metaraminol bitartrate, metaxalone, methacholine chloride, methazolamide, methenamine hippurate, methocarbamol, methotrexate, methoxsalen, methscopolamine bromide, methsuximide, methyclothiazide, methyl aminolevulinate·HCl, methylergonovine maleate, metolazone, metyrapone, mexiletine·HCl, micafungin, miconazole, midodrine·HCl, miglitol, milnacipran·HCl, mirtazapine, mitotane, moexipril·HCl, mometasone furoate, mupirocin, nadolol, nafcillin·Na, naftifine·HCl, naratriptan·HCl, natamycin, nebivolol·HCl, nelarabine, nepafenac, nevirapine, niacin, nicotine, nilotinib, nilutamide, nitazoxanide, nitisinone, nitrofurantoin, nizatidine, nortriptyline·HCl, olsalazine·Na, orlistat, oxaprozin, oxtriphylline, oxybutynin Chloride, oxytetracycline·HCl, paliperidone, palonosetron·HCl, paromomycin sulfate, pazopanib·HCl, pemetrexed disodium, pemirolast potassium, penicillamine, penicillin G potassium, pentamidine isethionate, pentostatin, perindopril erbumine, permethrin, perphenazine, phenelzine sulfate, phenylephrine, phytonadione, pimecrolimus, pitavastatin calcium, and podofilox |
| SmBit–DDB1 expressing DNA plasmid | Our laboratory | Available upon request | |
| Trypsin-EDTA | Sigma Aldrich | T4049 |
References
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