등지성 폴리비닐 알코올 스폰지 이식 및 절제 꼬리 피부 상처 모델을 사용하여 급성 상처 치유의 평가.
Summary
여기서, 2개의 뮤린 상처 치유 모델이 기술되고, 하나는 세포 및 사이토카인 상처 치유 반응을 평가하기 위해 고안되고 다른 하나는 상처 폐쇄의 속도를 정량화하도록 설계된다. 이 방법은 가난한 상처 치유의 각종 양상에 의하여 기계장치를 결정하기 위하여 당뇨병과 같은 복잡한 질병 모형으로 이용될 수 있습니다.
Abstract
상처 치유는 염증, 과립 조직 형성, 섬유증 및 분해의 질서 정연한 진행을 필요로하는 복잡한 과정입니다. Murine 모델은 이러한 프로세스에 대한 귀중한 기계적 통찰력을 제공합니다. 그러나 상처 치유 반응의 모든 측면을 완전히 해결하는 단일 모델은 없습니다. 대신 여러 모델을 사용하여 상처 치유의 다양한 측면을 해결하는 것이 이상적입니다. 여기서, 상처 치유 반응의 다양한 양상을 해결하는 두 가지 다른 방법이 설명된다. 첫 번째 모델에서, 폴리 비닐 알코올 스폰지는 피하 마우스 dorsum을 따라 이식된다. 스폰지 검색 다음, 세포는 기계적 중단에 의해 분리 될 수 있으며, 유체는 원심 분리에 의해 추출 될 수있다, 따라서 급성 상처 환경에서 세포 및 사이토 카인 반응의 상세한 특성을 허용. 이 모델의 한계는 상처 폐쇄 속도를 평가할 수 없다는 것입니다. 이를 위해 꼬리 피부 절제 모델이 활용됩니다. 이 모델에서는 꼬리 의 기저부 근처의 등쪽 표면을 따라 10mm x 3mm 직사각형 의 꼬리 스킨 조각을 절제합니다. 이 모델은 치부 분석을 위해 쉽게 촬영하여 치유 속도를 결정할 수 있으며 조직학적 분석을 위해 절제될 수 있습니다. 설명된 두 방법 모두 유리하게 변경된 마우스 긴장에서 이용될 수 있습니다, 또는 상처 치유 기계장치를 해명하기 위하여 당뇨병, 노화, 또는 이차 감염과 같은 comorbid 조건의 모형과 함께.
Introduction
상처 치유 과정을 검사할 수 있는 많은 뮤린 모델 시스템이 있으며, 각각 특정 한 장점과 한계를 가지고1,,2. 다음 방법은 두 개의 뮤린 상처 모델을 제시하며, 각 모델은 상처 치유 반응의 특정 측면을 다루고 부상에 대한 반응에서 교란의 원인과 효과를 식별하는 데 사용할 수 있습니다. 상처 치유 과정은 별개의 단계에서 발생합니다. 첫 번째 단계는 혈소판, 호중구 및 단핵구 / 대식세포의 급속한 유입뿐만 아니라 전염증성 사이토 카인 및 케모카인의 생산을 특징으로하는 염증성입니다. 염증의 해결에 따라, 환경은 profibrotic 및 proangiogenic 사이토 카인 및 성장 인자의 유도와 함께 더 회복 상태로 전환. 과립 조직은 증착되고 신혈관은 근섬유 아세포, 섬유 아세포, 상피 세포 및 내피 세포의 이동과 함께 형성됩니다. 최종 단계에서 임시 세포 외 매트릭스가 리모델링되고 흉터 형성 및 상처 폐쇄가2,3,34,45,5,66,7,,8로진행됩니다.
어떤 단일 뮤린 모델은 상처 치유의 모든 단계를 연구하는 시스템을 제공하지않습니다 2. 여기에서, 2개의 외과 상처 모형은 기술됩니다: 1개는 심각한 세포 및 사이토카인 상처 치유 반응을 설명하고, 다른 하나는 조직학 분석 뿐만 아니라 상처 폐쇄의 평가를 허용합니다. 이들 두 가지 방법은 상처 치유 반응의 상이한 양상에 대한 섭동 또는 동반의 효과를 평가하기 위해 상호 보완적인 방식으로 사용될 수 있다. 폴리 비닐 알코올 (PVA) 스폰지의 등쪽 피하 이식은 세포 및 과립 조직반응의다양한 측면을 해명하기 위해 수십 년 동안 설치류 모델에 사용되어 왔다 시스템9,10, 11,,12,,11,13,,14,,15,,16,,17,,18,,19,,20 ,21,22,23,,24. 이 접근법은 사이토카인이 풍부한 상처 액과 세포 침투를 검색할 수 있게 합니다. 이 모델에서는 1cm x 1cm x 0.5 cm 크기의 PVA 스폰지가 후방 등쪽 중간선에서 제작된 2cm 절개를 통해 피하 포켓에 넣습니다. 절개는 수술 클립으로 닫혀 있으며, 스폰지는 세포와 유체 격리를위한 이후 시점에서 검색 할 수 있습니다. 분리된 스폰지의 세포 및 사이토카인 밀리유는 약 14일 간 이식 후 급성 상처 치유의 정상적인 단계를 반영한다. 나중 시점에서 모델은 과립 조직 형성 및 이물질 반응1을연구하는 데 더 유리하다. 이 시스템을 사용하면 다른 생검 기반 방법,,,1,,22,23,25,26에서세포를 분리하는 것에 비해 자형및 기능성 세포 및 RNA 분리에 대한 뚜렷한 이점을 제공하는 >106 세포를 분리할 수 있습니다.
상처 폐쇄율은 꼬리 피부 절제 모델을 사용하여 결정됩니다. 이 모델에서, 처음에 Falanga 등에서 설명한 바와 같이 다른 사람에 의해 보고27,,28,,29,,30,꼬리 피부의 1cm x 0.3 cm 전체 두께 섹션은 꼬리의 기저 부근에서 제거된다. 상처 부위는 쉽게 시각화되고 시간이 지남에 따라 측정 할 수 있습니다. 대안적으로, 꼬리 조직은 조직학적 분석을 위해 분리될 수 있다. 이러한 접근법은 잘 확립된 등쪽 펀치 생검 방법에 대한 대안으로서 또는 이를 사용할 수 있다. 이 두 모델 사이의 주요 차이점은 상처 폐쇄율, 모피의 존재 또는 부재, 및 피부 구조22,31,,32입니다. 꼬리 피부 상처는 전체 폐쇄가 발생하기까지 약 21 일이 걸리기 때문에 상처 폐쇄를 평가하는 더 긴 기간을 제공합니다. 이것은 파니큘러스 카르누스의 작용으로 인해 주로 수축에 의해 훨씬 더 빨리 (~ 7-10 일) 치유되는 부목되지 않은 등쪽 펀치 생검에 반대합니다. 부목 등쪽 펀치 생검은 더 느리게 치유하고 수축 치유의 효과를 감소시키지만, 수축계메커니즘을제한하기 위해 이물질의 존재에 의존한다1,2,27,,30,,31,,33.,
설명된 상처 모델은 교란이 없는 정상적인 상처 치유 과정을 이해하는 데 유익합니다. 설치류 피부의 치유는 느슨한 구조, 수축성 치유에 대한 의존성 및 기타 해부학적 차이를 포함하여 인간의 피부와 매우 중요한 면에서 다르지만, 뮤린 시스템은 기계론및 선별 연구에 특정 한 이점을 제공합니다. 이들 중 가장 중요한 것은 근친 균주와 유전 돌연변이체의 가용성, 유전 적 견인성 및 낮은 비용입니다. 뮤린 연구에서 얻은 기계적 통찰력은 돼지 계통2,,31과같은 인간의 피부 치유를 보다 밀접하게 모방하는 복잡한 동물 모델로 번역될 수 있다.
안정된 상태에서 상처 치유 반응을 검사하는 것 외에도, 이러한 모델은 세포, 사이토카인 및 총 조직 수준에서 상처 치유 결함의 기초를 이해하기 위해 comorbid 조건과 결합 될 수 있습니다. 이러한 특정 환경에서는 수술 후 폐렴과 같은 특정 동반 질환 상태의 효과를 평가하기 위해 두 모델이 함께 사용될 수 있으며, 급성 세포 상처 치유 반응 및 상처폐쇄속도(30)에대한 반응도 있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 문서는 급성 상처 치유 반응의 평가를 허용 하는 두 가지 견인 뮤린 상처 모델을 설명 합니다. 첫 번째 방법은 등지 피하 공간에서 PVA 스폰지의 외과 이식을 포함한다. 이 접근법은 고립된 스폰지로부터 수득된 많은 수의 세포 및 상처 체액의 양으로 인해 세포 상처 치유 반응을 연구하기 위한 생검 기반 상처 모델보다 뚜렷한 이점을 제공한다. 이 절차의 성공적인 실행을 위해, 절개 주위 피부?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 브라운 대학 유동 세포 분석 및 선별 시설의 케빈 칼슨 (Kevin Carlson)에게 유동 세포 분석 실험에 대한 상담 및 지원에 감사드립니다. 그림 1B 및 C의 이미지는 BioRender로 작성되었습니다. 카일 리와 그레고리 세르파는 사진 촬영에 도움을 준 것에 대해 감사를 표한다. 이 작품은 다음과 같은 보조금에 의해 지원되었다: 국방 고급 연구 프로젝트 기관 (DARPA) YFAA15 D15AP0100, 신흥 새로운 과학 상 (브라운 대학), 국립 심장 폐 혈액 연구소 (NHLBI) 1R01HL126887-01A1, 국립 환경 과학 연구소 (NIES) T32-ES7272 (환경 병리학 교육), 브라운 대학 연구 종자 상.
Materials
| 10x Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | BP3991 | |
| 15 mL centrifuge tubes, Olympus | Genesee | 28-103 | |
| 1x HBSS (+Calcium, +Magnesium, –Phenol Red) | ThermoFisher Scientific | 14025076 | |
| 5ml Syringe | BD | 309646 | |
| Anti-mouse CD45.2-APC Fire750 | BioLegend | 109852 | Clone 104 |
| Anti-mouse F4/80-eFluor660 | ThermoFisher Scientific | 50-4801-82 | Clone BM8 |
| Anti-mouse Ly6C-FITC | BD Biosciences | 553104 | Clone AL-21 |
| Anti-mouse Ly6G-PerCP-eFluor710 | ThermoFisher Scientific | 46-9668-82 | Clone 1A8-Ly6g |
| Anti-mouse Siglec-F-APC-R700 | BD Biosciences | 565183 | Clone E50-2440 |
| Autoclip Stainless Steel Wound Clip Applier | Braintree Scientific | NC9021392 | |
| Autoclip Stainless Steel Wound Clips, 9mm | Braintree Scientific | NC9334081 | |
| Blender Bag, 80mL | Fisher Scientific | 14258201 | |
| Culture Tube, 16mL, 17×100 | Genesee Scientific | 21-130 | |
| Fetal Bovine Serum – Standard | ThermoFisher Scientific | 10437028 | |
| Fixable Viability Dye eFluor506 | ThermoFisher Scientific | 65-0866-14 | |
| Hepes Solution, 1M | Genesee Scientific | 25-534 | |
| ImageJ Software | NIH | ||
| Penicillin-Streptomycin (5000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15070-063 | |
| Polyvinyl alcohol sponge – large pore size | Ivalon/PVA Unlimited | www.sponge-pva.com | |
| Povidone-iodine solution, 10% | Fisher Scientific | 3955-16 | |
| Spray barrier film, Cavilon | 3M | 3346E | |
| Stomacher 80 Biomaster, 110V | Seward | 0080/000/AJ |
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