Analyse av sidepopulasjon i faste tumorcellelinjer
Summary
En praktisk, rask og kostnadseffektiv metode for å måle andelen sidepopulasjonsceller i faste tumorcellelinjer presenteres.
Abstract
Kreft stamceller (CSC) er en viktig årsak til tumorvekst, metastase og tilbakefall. Isolasjon og identifisering av CSC-er har stor betydning for tumorforskning. For tiden brukes flere teknikker for identifisering og rensing av CSC fra tumorvev og tumorcellelinjer. Separasjon og analyse av sidepopulasjonsceller (SP) er to av de ofte brukte metodene. Metodene er avhengige av CSCCs evne til raskt å utvise fluorescerende fargestoffer, for eksempel Hoechst 33342. Effluksen av fargestoffet er forbundet med ATP-bindende kassett (ABC) transportører og kan hemmes av ABC-transportørhemmere. Metoder for farging av dyrkede tumorceller med Hoechst 33342 og analyse av andelen sp-celler ved strømningscytometri er beskrevet. Denne analysen er praktisk, rask og kostnadseffektiv. Data generert i denne analysen kan bidra til en bedre forståelse av effekten av gener eller andre ekstracellulære og intracellulære signaler på stamcellenes stammeegenskaper.
Introduction
Kreft stamceller (CSC) er undergrupper av celler med selvfornyelse evne og flere differensiering potensial, som spiller en viktig rolle i tumor vekst, metastase, og tilbakefall1,2. For tiden har CSC blitt identifisert til å eksistere i en rekke ondartede svulster, inkludert lunge,hjerne, bukspyttkjertel, prostata, bryst- og leverkreft3,4,5,6,7,8,9. Identifisering av CSCer i disse svulstene er hovedsakelig basert på tilstedeværelsen av overflatemarkørproteiner, for eksempel høyt og / eller lavt uttrykk for CD44, CD24, CD133 og Sca-19,10, men en unik markør som kan skille CSC-er fra ikke-CSC-er er ikke rapportert så langt. For tiden brukes flere teknikker til å identifisere og rense CSC-er i tumorvev eller tumorcellelinjer. Disse teknikkene er utformet basert på de spesifikke egenskapene til CSC-er. Blant dem er analyser og sortering av sidepopulasjonsceller (SP) to av de ofte brukte metodene.
SP-celler ble opprinnelig oppdaget av Goodell et al.11, da de karakteriserte hematopoietiske stamceller i musebenmargsceller. Da musebenmargscellene ble merket med det fluorescerende fargestoffet Hoechst 33342, oppstod en liten gruppe Hoechst 33342 svakt fargede celler i den todimensjonale prikkplottet av en strømningscytometrianalyse. Hoechst 33342 er et DNA-bindende fargestoff og har minst to bindingsmoduser som fører til forskjellige spektrale egenskaper. Når du ser på fluorescensutslipp ved to bølgelengder samtidig, kan flere populasjoner avsløres12. I analysen var Hoechst 33342 spent på 350 nm og fluorescensen ble målt ved hjelp av 450/20 nm båndpass (BP) filter og 675 nm kantfilter langpass (EFLP)11. Sammenlignet med hele populasjonen av benmargsceller, ble denne gruppen av celler beriket med hematopoietiske stamceller kalt SP-celler11. SP-celler er i stand til raskt å utvise Hoechst 33342. Effluksen av dette fargestoffet er relatert til ATP-bindende kassett (ABC) transportører13, som kan hemmes av noen midler som Fumitremorgin C14, Verapamil og Reserpine15,16. Deretter ble forskjellige proporsjoner av SP-celler oppdaget i en rekke vev, organer, tumorvev og tumorcellelinjer17,18,19. Disse SP-cellene har mange egenskaper vedstamceller 17,19.
Dette manuskriptet beskriver Hoechst 33342 merking og farging av dyrkede tumorceller og analyse av SP-celler ved strømningscytometri. Videre vises optimalisering av Hoechst 33342-konsentrasjonen og riktig blokkeringsvalg for en bestemt tumorcellelinje ved hjelp av denne tilnærmingen. Til slutt er effekten av stemnessfremming eller hemmingssignaler på andelen SP i tumorceller demonstrert. De eksperimentelle eksemplene viser at analyse av SP kan brukes til å utforske effekten av ulike signaler, for eksempel genuttrykk, små hemmere, aktivatorer, cytokiner og kjemokiner, på tumorstamme. Sammenlignet med andre metoder for isolering og rensing av CSC-er, for eksempel sortering av CD44+/ CD24– befolkning, aldehyd dehydrogenase (ALDH) analyse og tumorsfæredannelsesanalyser, er denne metoden lettere for manipulering og er kostnadseffektiv.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det er flere viktige punkter å huske på for SP-analysen. Den første er valget av en riktig blokkering, for eksempel Verapamil eller Reserpine, for hver cellelinje, fordi “gate” -plasseringen av SP-cellene bestemmes i henhold til posisjonen der et stort antall SP-celler forsvinner etter tilsetning av blokkeringen. For MDA-MB-231-cellelinjen fungerer Reserpine bra. For andre cellelinjer kan imidlertid forskjellige blokkeringer fungere bedre.
Den andre er konsentrasjonen av Hoechst 33342. Ande…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble finansiert av Natural Science Foundation of China 81572599, 81773124 og 81972787; Tianjin bys naturvitenskapelige stiftelse (Kina) 19JCYBJC27300; Tianjin People’s Hospital &Nankai University Collaborative Research Grant 2016rmnk005; Grunnleggende forskningsmidler for de sentrale universitetene, Nankai University 63191153.
Materials
| 6 well cell culture plate | CORNING | 3516 | 9.5 cm2 (approx.) |
| Colivelin | MCE | HY-P1061A | Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala-Pro-Ala-Gly-Ala-Ser-Arg-Leu-Leu-Leu-Leu-Thr-Gly-Glu-Ile-Asp-Leu-Pro |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biological Industries (BIOIND) | 04-001-1ACS | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | BD LSRFortessa | |
| Flow cytometer software | BD Biosciences | FACSDiva | |
| Flow cytometry analysis software | BD Biosciences | FlowJo | |
| Hoechst33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | bisBenzimide H 33342 trihydrochloride |
| Polystyrene round bottom test tube | CORNING | 352054 | 12 x 75 mm, 5mL |
| Propidium iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4170 | 3,8-Diamino-5-[3-(diethylmethylammonio)propyl]-6-phenylphenanthridinium diiodide |
| Reserpine | Sigma-Aldrich | 83580 | (3β, 16β, 17α, 18β, 20α)-11,17-Dimethoxy-18-[(3,4,5-trimethoxybenzoyl)oxy]yohimban-16-carboxylic acid methyl ester |
| SKLB816 | Provided by Dr. Shengyong Yang, Sichuan University | ||
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200072 | |
| Verapamil hydrochloride | Sigma-Aldrich | V4629 | 5-[N-(3,4-Dimethoxyphenylethyl)methylamino]-2-(3,4-dimethoxyphenyl)-2-isopropylvaleronitrile hydrochloride |
References
- Reya, T., Morrison, S. J., Clarke, M. F., Weissman, I. L. Stem cells, cancer, and cancer stem cells. Nature. 414 (6859), 105-111 (2001).
- Batlle, E., Clevers, H. Cancer stem cells revisited. Nature Medicine. 23 (10), 1124-1134 (2017).
- Eramo, A., et al. Identification and expansion of the tumorigenic lung cancer stem cell population. Cell Death & Differentiation. 15 (3), 504-514 (2008).
- Kahlert, U. D., et al. CD133/CD15 defines distinct cell subpopulations with differential in vitro clonogenic activity and stem cell-related gene expression profile in in vitro propagated glioblastoma multiforme-derived cell line with a PNET-like component. Folia Neuropathologica. 50 (4), 357-368 (2012).
- Bailey, J. M., et al. DCLK1 marks a morphologically distinct subpopulation of cells with stem cell properties in preinvasive pancreatic cancer. Gastroenterology. 146 (1), 245-256 (2014).
- Hurt, E. M., Kawasaki, B. T., Klarmann, G. J., Thomas, S. B., Farrar, W. L. CD44+ CD24(-) prostate cells are early cancer progenitor/stem cells that provide a model for patients with poor prognosis. British Journal of Cancer. 98 (4), 756-765 (2008).
- Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 100 (7), 3983-3988 (2003).
- Yang, Z. F., et al. Significance of CD90+ cancer stem cells in human liver cancer. Cancer Cell. 13 (2), 153-166 (2008).
- Schulenburg, A., et al. Cancer stem cells in basic science and in translational oncology: can we translate into clinical application. Journal of Hematology & Oncolcology. 8, 16 (2015).
- Park, J. W., Park, J. M., Park, D. M., Kim, D. Y., Kim, H. K. Stem Cells Antigen-1 Enriches for a Cancer Stem Cell-Like Subpopulation in Mouse Gastric Cancer. Stem Cells. 34 (5), 1177-1187 (2016).
- Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. Journal of Experimental Medicine. 183 (4), 1797-1806 (1996).
- Goodell, M. A. Stem cell identification and sorting using the Hoechst 33342 side population (SP). Current Protocols in Cytometry. , 18 (2005).
- Begicevic, R. R., Falasca, M. ABC Transporters in Cancer Stem Cells: Beyond Chemoresistance. International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2362 (2017).
- Rabindran, S. K., Ross, D. D., Doyle, L. A., Yang, W., Greenberger, L. M. Fumitremorgin C reverses multidrug resistance in cells transfected with the breast cancer resistance protein. 암 연구학. 60 (1), 47-50 (2000).
- Takara, K., et al. Differential effects of calcium antagonists on ABCG2/BCRP-mediated drug resistance and transport in SN-38-resistant HeLa cells. Molecular Medicine Reports. 5 (3), 603-609 (2012).
- Matsson, P., Pedersen, J. M., Norinder, U., Bergstrom, C. A., Artursson, P. Identification of novel specific and general inhibitors of the three major human ATP-binding cassette transporters P-gp, BCRP and MRP2 among registered drugs. Pharmaceutical Research. 26 (8), 1816-1831 (2009).
- Challen, G. A., Little, M. H. A side order of stem cells: the SP phenotype. Stem Cells. 24 (1), 3-12 (2006).
- Wu, C., Alman, B. A. Side population cells in human cancers. Cancer Letters. 268 (1), 1-9 (2008).
- Patrawala, L., et al. Side population is enriched in tumorigenic, stem-like cancer cells, whereas ABCG2+ and ABCG2- cancer cells are similarly tumorigenic. 암 연구학. 65 (14), 6207-6219 (2005).
- Yamada, M., et al. Nasal Colivelin treatment ameliorates memory impairment related to Alzheimer’s disease. Neuropsychopharmacology. 33 (8), 2020-2032 (2008).
- Marotta, L. L., et al. The JAK2/STAT3 signaling pathway is required for growth of CD44(+)CD24(-) stem cell-like breast cancer cells in human tumors. Journal of Clinical Investigation. 121 (7), 2723-2735 (2011).
- Zhang, C. H., et al. From Lead to Drug Candidate: Optimization of 3-(Phenylethynyl)-1H-pyrazolo[3,4-d]pyrimidin-4-amine Derivatives as Agents for the Treatment of Triple Negative Breast Cancer. Journal of Medicnal Chemistry. 59 (21), 9788-9805 (2016).
- Tam, W. L., et al. Protein kinase C alpha is a central signaling node and therapeutic target for breast cancer stem cells. Cancer Cell. 24 (3), 347-364 (2013).
- Ibrahim, S. F., Diercks, A. H., Petersen, T. W., van den Engh, G. Kinetic analyses as a critical parameter in defining the side population (SP) phenotype. Experimental Cell Research. 313 (9), 1921-1926 (2007).
- Petriz, J. Flow cytometry of the side population (SP). Current Protocol in Cytometry. , 23 (2013).
- Hiraga, T., Ito, S., Nakamura, H. Side population in MDA-MB-231 human breast cancer cells exhibits cancer stem cell-like properties without higher bone-metastatic potential. Oncology Reports. 25 (1), 289-296 (2011).
- Shen, W., et al. ICAM3 mediates inflammatory signaling to promote cancer cell stemness. Cancer Letters. 422, 29-43 (2018).
- Koh, S. Y., Moon, J. Y., Unno, T., Cho, S. K. Baicalein Suppresses Stem Cell-Like Characteristics in Radio- and Chemoresistant MDA-MB-231 Human Breast Cancer Cells through Up-Regulation of IFIT2. Nutrients. 11 (3), 624 (2019).
- Lee, H., Park, S., Kim, J. B., Kim, J., Kim, H. Entrapped doxorubicin nanoparticles for the treatment of metastatic anoikis-resistant cancer cells. Cancer Letters. 332 (1), 110-119 (2013).
- Ota, M., et al. ADAM23 is downregulated in side population and suppresses lung metastasis of lung carcinoma cells. Cancer Science. 107 (4), 433-443 (2016).
- Wei, H., et al. The mechanisms for lung cancer risk of PM2.5 : Induction of epithelial-mesenchymal transition and cancer stem cell properties in human non-small cell lung cancer cells. Environmental Toxicology. 32 (11), 2341-2351 (2017).
- Prasanphanich, A. F., White, D. E., Gran, M. A., Kemp, M. L. Kinetic Modeling of ABCG2 Transporter Heterogeneity: A Quantitative, Single-Cell Analysis of the Side Population Assay. PLoS Computational Biology. 12 (11), 1005188 (2016).
- Han, H., et al. An endogenous inhibitor of angiogenesis inversely correlates with side population phenotype and function in human lung cancer cells. Oncogene. 33 (9), 1198-1206 (2014).
- Loebinger, M. R., Sage, E. K., Davies, D., Janes, S. M. TRAIL-expressing mesenchymal stem cells kill the putative cancer stem cell population. British Journal of Cancer. 103 (11), 1692-1697 (2010).
- Chiba, T., et al. Side population purified from hepatocellular carcinoma cells harbors cancer stem cell-like properties. Hepatology. 44 (1), 240-251 (2006).
- Hirschmann-Jax, C., et al. A distinct “side population” of cells with high drug efflux capacity in human tumor cells. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 101 (39), 14228-14233 (2004).
- Chen, A. Y., Yu, C., Gatto, B., Liu, L. F. DNA minor groove-binding ligands: a different class of mammalian DNA topoisomerase I inhibitors. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 90 (17), 8131-8135 (1993).
