Анализ боковой популяции в линиях солидных опухолевых клеток
Summary
Представлен удобный, быстрый и экономичный метод измерения доли побочных популяционных клеток в сплошных опухолевых клеточных линиях.
Abstract
Раковые стволовые клетки (CSC) являются важной причиной роста опухоли, метастазирования и рецидива. Выделение и идентификация ЦСК имеют большое значение для исследования опухолей. В настоящее время для идентификации и очистки ЦСК из опухолевых тканей и опухолевых клеточных линий используется несколько методик. Разделение и анализ клеток боковой популяции (SP) являются двумя из широко используемых методов. Методы основаны на способности CSC быстро вытеснять флуоресцентные красители, такие как Hoechst 33342. Отток красителя связан с транспортерами АТФ-связывающей кассеты (ABC) и может ингибироваться ингибиторами транспортера ABC. Описаны методы окрашивания культивируемых опухолевых клеток Hoechst 33342 и анализа доли их SP-клеток методом проточной цитометрии. Этот анализ удобен, быстр и экономичен. Данные, полученные в этом анализе, могут способствовать лучшему пониманию влияния генов или других внеклеточных и внутриклеточных сигналов на свойства стволов опухолевых клеток.
Introduction
Раковые стволовые клетки (CSC) представляют собой подмножества клеток с способностью к самообновлению и множественным дифференцировыванием, которые играют жизненно важную роль в росте опухоли, метастазировании и рецидиве1,2. В настоящее время было идентифицировано, что CSC существуют при различных злокачественных опухолях, включая рак легких, головного мозга, поджелудочной железы, предстательной железы, молочной железы и печени3,4,5,6,7,8,9. Идентификация CSC в этих опухолях в основном основана на присутствии поверхностных маркерных белков, таких как высокая и / или низкая экспрессия CD44, CD24, CD133 и Sca-19,10,но уникальный маркер, который может отличить CSC от не-CSC, до сих пор не сообщалось. В настоящее время несколько методов используются для выявления и очистки ЦСК в опухолевой ткани или клеточных линиях опухоли. Эти методы разработаны на основе специфических свойств CSC. Среди них анализы и сортировка клеток боковой популяции (SP) являются двумя из широко используемых методов.
SP-клетки были первоначально обнаружены Goodell et al.11,когда они характеризовали гемопоэтические стволовые клетки в клетках костного мозга мыши. Когда клетки костного мозга мыши были помечены флуоресцентным красителем Hoechst 33342, небольшая группа клеток Hoechst 33342 с тусклым окрашиванием появилась на двумерном точечном графике анализа проточной цитометрии. Hoechst 33342 является ДНК-связывающим красителем и имеет, по меньшей мере, два режима связывания, которые приводят к различным спектральным характеристикам. При просмотре флуоресцентного излучения на двух длинах волн одновременно можно выявить несколько популяций12. В их анализе Hoechst 33342 возбуждался при 350 нм, а флуоресценция измерялась с помощью полосового фильтра 450/20 нм (BP) и 675 нм краевого фильтра длинных проходов (EFLP)11. По сравнению со всей популяцией клеток костного мозга, эта группа клеток была обогащена гемопоэтическими стволовыми клетками, называемыми SP-клетками11. КЛЕТКИ SP способны быстро вытеснять Hoechst 33342. Отток этого красителя связан с АТФ-связывающими кассетными (ABC) транспортерами13,которые могут ингибироваться некоторыми агентами, такими как ФумитреморгинС14,Верапамил и Резерпин15,16. После этого различные пропорции SP-клеток были обнаружены в различных тканях, органах, опухолевых тканях и опухолевых клеточных линиях17,18,19. Эти SP-клетки имеют много характеристик стволовых клеток17,19.
Эта рукопись описывает маркировку и окрашивание культивированных опухолевых клеток Hoechst 33342 и анализ SP-клеток методом проточной цитометрии. Кроме того, показана оптимизация концентрации Hoechst 33342 и правильный выбор блокатора для конкретной линии опухолевых клеток с использованием этого подхода. Наконец, продемонстрировано влияние сигналов продвижения или ингибирования стволовойсти на долю SP в опухолевых клетках. Экспериментальные примеры демонстрируют, что анализ SP может быть использован для изучения влияния различных сигналов, таких как экспрессия генов, небольшие ингибиторы, активаторы, цитокины и хемокины, на стволовую опухоль. По сравнению с другими методами выделения и очистки ЦСК, такими как сортировка CD44+/ CD24– популяция, анализ альдегиддегидрогеназы (ALDH) и анализы образования опухолевой сферы, этот метод проще для манипуляций и является экономически эффективным.
Protocol
Representative Results
Discussion
Есть несколько ключевых моментов, которые следует иметь в виду для анализа SP. Во-первых, это выбор правильного блокиратора, такого как Верапамил или Резерпин, для каждой клеточной линии, потому что «затворное» расположение КЛЕТОК SP определяется в соответствии с положением, в котором бо?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа финансировалась Фондом естественных наук Китая 81572599, 81773124 и 81972787; Фонд естественных наук города Тяньцзинь (Китай) 19JCYBJC27300; Тяньцзиньская народная больница и Грант на совместные исследования Университета Нанькай 2016rmnk005; Фонды фундаментальных исследований для центральных университетов, Нанькайского университета 63191153.
Materials
| 6 well cell culture plate | CORNING | 3516 | 9.5 cm2 (approx.) |
| Colivelin | MCE | HY-P1061A | Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala-Pro-Ala-Gly-Ala-Ser-Arg-Leu-Leu-Leu-Leu-Thr-Gly-Glu-Ile-Asp-Leu-Pro |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biological Industries (BIOIND) | 04-001-1ACS | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | BD LSRFortessa | |
| Flow cytometer software | BD Biosciences | FACSDiva | |
| Flow cytometry analysis software | BD Biosciences | FlowJo | |
| Hoechst33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | bisBenzimide H 33342 trihydrochloride |
| Polystyrene round bottom test tube | CORNING | 352054 | 12 x 75 mm, 5mL |
| Propidium iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4170 | 3,8-Diamino-5-[3-(diethylmethylammonio)propyl]-6-phenylphenanthridinium diiodide |
| Reserpine | Sigma-Aldrich | 83580 | (3β, 16β, 17α, 18β, 20α)-11,17-Dimethoxy-18-[(3,4,5-trimethoxybenzoyl)oxy]yohimban-16-carboxylic acid methyl ester |
| SKLB816 | Provided by Dr. Shengyong Yang, Sichuan University | ||
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200072 | |
| Verapamil hydrochloride | Sigma-Aldrich | V4629 | 5-[N-(3,4-Dimethoxyphenylethyl)methylamino]-2-(3,4-dimethoxyphenyl)-2-isopropylvaleronitrile hydrochloride |
References
- Reya, T., Morrison, S. J., Clarke, M. F., Weissman, I. L. Stem cells, cancer, and cancer stem cells. Nature. 414 (6859), 105-111 (2001).
- Batlle, E., Clevers, H. Cancer stem cells revisited. Nature Medicine. 23 (10), 1124-1134 (2017).
- Eramo, A., et al. Identification and expansion of the tumorigenic lung cancer stem cell population. Cell Death & Differentiation. 15 (3), 504-514 (2008).
- Kahlert, U. D., et al. CD133/CD15 defines distinct cell subpopulations with differential in vitro clonogenic activity and stem cell-related gene expression profile in in vitro propagated glioblastoma multiforme-derived cell line with a PNET-like component. Folia Neuropathologica. 50 (4), 357-368 (2012).
- Bailey, J. M., et al. DCLK1 marks a morphologically distinct subpopulation of cells with stem cell properties in preinvasive pancreatic cancer. Gastroenterology. 146 (1), 245-256 (2014).
- Hurt, E. M., Kawasaki, B. T., Klarmann, G. J., Thomas, S. B., Farrar, W. L. CD44+ CD24(-) prostate cells are early cancer progenitor/stem cells that provide a model for patients with poor prognosis. British Journal of Cancer. 98 (4), 756-765 (2008).
- Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 100 (7), 3983-3988 (2003).
- Yang, Z. F., et al. Significance of CD90+ cancer stem cells in human liver cancer. Cancer Cell. 13 (2), 153-166 (2008).
- Schulenburg, A., et al. Cancer stem cells in basic science and in translational oncology: can we translate into clinical application. Journal of Hematology & Oncolcology. 8, 16 (2015).
- Park, J. W., Park, J. M., Park, D. M., Kim, D. Y., Kim, H. K. Stem Cells Antigen-1 Enriches for a Cancer Stem Cell-Like Subpopulation in Mouse Gastric Cancer. Stem Cells. 34 (5), 1177-1187 (2016).
- Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. Journal of Experimental Medicine. 183 (4), 1797-1806 (1996).
- Goodell, M. A. Stem cell identification and sorting using the Hoechst 33342 side population (SP). Current Protocols in Cytometry. , 18 (2005).
- Begicevic, R. R., Falasca, M. ABC Transporters in Cancer Stem Cells: Beyond Chemoresistance. International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2362 (2017).
- Rabindran, S. K., Ross, D. D., Doyle, L. A., Yang, W., Greenberger, L. M. Fumitremorgin C reverses multidrug resistance in cells transfected with the breast cancer resistance protein. 암 연구학. 60 (1), 47-50 (2000).
- Takara, K., et al. Differential effects of calcium antagonists on ABCG2/BCRP-mediated drug resistance and transport in SN-38-resistant HeLa cells. Molecular Medicine Reports. 5 (3), 603-609 (2012).
- Matsson, P., Pedersen, J. M., Norinder, U., Bergstrom, C. A., Artursson, P. Identification of novel specific and general inhibitors of the three major human ATP-binding cassette transporters P-gp, BCRP and MRP2 among registered drugs. Pharmaceutical Research. 26 (8), 1816-1831 (2009).
- Challen, G. A., Little, M. H. A side order of stem cells: the SP phenotype. Stem Cells. 24 (1), 3-12 (2006).
- Wu, C., Alman, B. A. Side population cells in human cancers. Cancer Letters. 268 (1), 1-9 (2008).
- Patrawala, L., et al. Side population is enriched in tumorigenic, stem-like cancer cells, whereas ABCG2+ and ABCG2- cancer cells are similarly tumorigenic. 암 연구학. 65 (14), 6207-6219 (2005).
- Yamada, M., et al. Nasal Colivelin treatment ameliorates memory impairment related to Alzheimer’s disease. Neuropsychopharmacology. 33 (8), 2020-2032 (2008).
- Marotta, L. L., et al. The JAK2/STAT3 signaling pathway is required for growth of CD44(+)CD24(-) stem cell-like breast cancer cells in human tumors. Journal of Clinical Investigation. 121 (7), 2723-2735 (2011).
- Zhang, C. H., et al. From Lead to Drug Candidate: Optimization of 3-(Phenylethynyl)-1H-pyrazolo[3,4-d]pyrimidin-4-amine Derivatives as Agents for the Treatment of Triple Negative Breast Cancer. Journal of Medicnal Chemistry. 59 (21), 9788-9805 (2016).
- Tam, W. L., et al. Protein kinase C alpha is a central signaling node and therapeutic target for breast cancer stem cells. Cancer Cell. 24 (3), 347-364 (2013).
- Ibrahim, S. F., Diercks, A. H., Petersen, T. W., van den Engh, G. Kinetic analyses as a critical parameter in defining the side population (SP) phenotype. Experimental Cell Research. 313 (9), 1921-1926 (2007).
- Petriz, J. Flow cytometry of the side population (SP). Current Protocol in Cytometry. , 23 (2013).
- Hiraga, T., Ito, S., Nakamura, H. Side population in MDA-MB-231 human breast cancer cells exhibits cancer stem cell-like properties without higher bone-metastatic potential. Oncology Reports. 25 (1), 289-296 (2011).
- Shen, W., et al. ICAM3 mediates inflammatory signaling to promote cancer cell stemness. Cancer Letters. 422, 29-43 (2018).
- Koh, S. Y., Moon, J. Y., Unno, T., Cho, S. K. Baicalein Suppresses Stem Cell-Like Characteristics in Radio- and Chemoresistant MDA-MB-231 Human Breast Cancer Cells through Up-Regulation of IFIT2. Nutrients. 11 (3), 624 (2019).
- Lee, H., Park, S., Kim, J. B., Kim, J., Kim, H. Entrapped doxorubicin nanoparticles for the treatment of metastatic anoikis-resistant cancer cells. Cancer Letters. 332 (1), 110-119 (2013).
- Ota, M., et al. ADAM23 is downregulated in side population and suppresses lung metastasis of lung carcinoma cells. Cancer Science. 107 (4), 433-443 (2016).
- Wei, H., et al. The mechanisms for lung cancer risk of PM2.5 : Induction of epithelial-mesenchymal transition and cancer stem cell properties in human non-small cell lung cancer cells. Environmental Toxicology. 32 (11), 2341-2351 (2017).
- Prasanphanich, A. F., White, D. E., Gran, M. A., Kemp, M. L. Kinetic Modeling of ABCG2 Transporter Heterogeneity: A Quantitative, Single-Cell Analysis of the Side Population Assay. PLoS Computational Biology. 12 (11), 1005188 (2016).
- Han, H., et al. An endogenous inhibitor of angiogenesis inversely correlates with side population phenotype and function in human lung cancer cells. Oncogene. 33 (9), 1198-1206 (2014).
- Loebinger, M. R., Sage, E. K., Davies, D., Janes, S. M. TRAIL-expressing mesenchymal stem cells kill the putative cancer stem cell population. British Journal of Cancer. 103 (11), 1692-1697 (2010).
- Chiba, T., et al. Side population purified from hepatocellular carcinoma cells harbors cancer stem cell-like properties. Hepatology. 44 (1), 240-251 (2006).
- Hirschmann-Jax, C., et al. A distinct “side population” of cells with high drug efflux capacity in human tumor cells. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 101 (39), 14228-14233 (2004).
- Chen, A. Y., Yu, C., Gatto, B., Liu, L. F. DNA minor groove-binding ligands: a different class of mammalian DNA topoisomerase I inhibitors. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 90 (17), 8131-8135 (1993).
