Análisis De La Población Lateral En Líneas Celulares De Tumores Sólidos

Summary

Un método conveniente, rápido, y rentable de medir la proporción de células de población laterales en variedades de células sólidas del tumor se presenta.

Abstract

Las células madre cancerosas (CSCs) son una causa importante del crecimiento del tumor, de la metástasis, y de la repetición. El aislamiento y la identificación de CSCs son de gran importancia para la investigación del tumor. Actualmente, varias técnicas se utilizan para la identificación y purificación de CSCs de tejidos del tumor y de variedades de células del tumor. La separación y el análisis de las células de la población lateral (SP) son dos de los métodos de uso general. Los métodos se basan en la capacidad de los CSCs para expulsar rápidamente los tintes fluorescentes, como Hoechst 33342. La emanación del tinte se asocia con los transportadores de cassette de unión a ATP (ABC) y puede ser inhibida por inhibidores del transportador ABC. Los métodos para la coloración de las células cultivadas del tumor con Hoechst 33342 y para analizar la proporción de sus células del SP por cytometry de flujo se describen. Este ensayo es conveniente, rápido y rentable. Los datos generados en este ensayo pueden contribuir a una mejor comprensión del efecto de los genes u otras señales extracelulares e intracelulares sobre las propiedades de stemness de las células tumorales.

Introduction

Las células madre cancerosas (CSCs) son subconjuntos de células con capacidad de autorre renovación y potencial de diferenciación múltiple, que desempeñan un papel vital en el crecimiento tumoral, la metástasis y la recurrencia^1,2. Actualmente, CSCs se han identificado para existir en una variedad de tumores malos, incluyendo pulmón, cerebro, páncreas, próstata, pecho, y cánceres del hígado^{3,4,5,6,7,8,9.} La identificación de CSCs en estos tumores se basa principalmente en la presencia de proteínas superficiales del marcador, tales como expresión alta y/o baja de CD44, de CD24, de CD133, y de^{Sca-1 9,10,}pero un marcador único que pueda distinguir CSCs de no-CSCs no se ha divulgado hasta ahora. Actualmente, varias técnicas se utilizan para identificar y purificar CSCs en tejido del tumor o variedades de células del tumor. Estas técnicas están diseñadas en base a las propiedades específicas de los CSCs. Entre ellos, los ensayos y la clasificación de las células de la población lateral (SP) son dos de los métodos comúnmente utilizados.

Las células SP fueron descubiertas originalmente por Goodell et al.^11,cuando caracterizaron células madre hematopoyéticas en células de médula ósea de ratón. Cuando las células de la médula del ratón fueron etiquetadas con el tinte fluorescente Hoechst 33342, un pequeño grupo de células Tenue-manchadas Hoechst 33342 apareció en el diagrama de dos dimensiones del punto de un análisis cytometry de flujo. Hoechst 33342 es un colorante de unión al ADN y tiene al menos dos modos de unión que conducen a diferentes características espectrales. Al ver la emisión de fluorescencia a dos longitudes de onda al mismo tiempo, se pueden revelar múltiples poblaciones¹². En su ensayo, el Hoechst 33342 se excitó a 350 nm y la fluorescencia se midió utilizando el filtro de paso de banda (BP) de 450/20 nm y el filtro de borde de 675 nm de paso largo (EFLP)^11. En comparación con toda la población de células de médula ósea, este grupo de células se enriqueció con células madre hematopoyéticas llamadas células SP^11. Las células SP son capaces de expulsar rápidamente Hoechst 33342. La emanación de este tinte está relacionada con los transportadores de cassette de unión a ATP (ABC)^13,que pueden ser inhibidos por algunos agentes como fumitremorgina C^14,verapamilo y reserpina^15,16. Después de eso, se detectaron diferentes proporciones de células SP en una variedad de tejidos, órganos, tejidos tumorales y líneas celulares^{tumorales 17,18,19.} Estas células SP tienen muchas características de las células madre^17,19.

Este manuscrito describe el etiquetado y la coloración de Hoechst 33342 de las células cultivadas del tumor y el análisis de las células del SP por cytometry de flujo. Por otra parte, la optimización de la concentración de Hoechst 33342 y la selección apropiada del molde para una variedades de células específica del tumor usando este acercamiento se muestran. Finalmente, se demuestran los efectos de las señales de promoción o inhibición del stemness sobre la proporción de SP en las células tumorales. Los ejemplos experimentales demuestran que el análisis del SP se puede utilizar para explorar los efectos de varias señales, tales como expresión génica, pequeños inhibidores, activadores, cytokines, y chemokines, sobre stemness del tumor. En comparación con otros métodos para el aislamiento y la purificación de CSCs, tales como clasificación de CD44⁺/ CD24^– población, análisis de aldehído deshidrogenasa (ALDH) y ensayos de formación de esfera tumoral, este método es más fácil de manipular y es rentable.

Protocol

1. Preparación celular Digestión celular y neutralización Sembrar células tumorales (como las células MDA-MB-231) en una placa de 6 pozos, y cultivarlas en una incubadora de 37 °C suministrada con 5% de CO2. Cosechar células cuando su densidad alcanza alrededor del 90%. Aspirar bien el medio de cultivo y lavar las células 2x con 3 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS).NOTA: Para examinar los efectos de los inhibidores de la vía de señalización (por ejemp…

Representative Results

Cuatro análisis experimentales del SP fueron realizados según este método. En el primero, detectamos la proporción de células SP en MDA-MB-231, que es una triple negativa de la línea celular humana del cáncer de seno, en condiciones normales. Después del recuento celular, Hoechst 33342 se añadió en un tubo que contenía 1 x 106 células a una concentración final de 3 μg/mL. Reserpina y Hoechst 33342 se añadieron a otro tubo a concentraciones finales de 40 μM y 3 μg/mL, respectivamente. El PI fue…

Discussion

Hay varios puntos clave a tener en cuenta para el ensayo SP. La primera es la selección de un bloqueador adecuado, como verapamilo o reserpina, para cada línea celular, porque la ubicación de la “puerta” de las células SP se determina de acuerdo con la posición en la que un gran número de células SP desaparecen después de la adición del bloqueador. Para la línea celular MDA-MB-231, Reserpine funciona bien. Sin embargo, para otras líneas celulares, diferentes bloqueadores podrían funcionar mejor.

<p class=…

Materials

6 well cell culture plate	CORNING	3516	9.5 cm2 (approx.)
Colivelin	MCE	HY-P1061A	Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala-Pro-Ala-Gly-Ala-Ser-Arg-Leu-Leu-Leu-Leu-Thr-Gly-Glu-Ile-Asp-Leu-Pro
Fetal bovine serum (FBS)	Biological Industries (BIOIND)	04-001-1ACS
Flow cytometer	BD Biosciences	BD LSRFortessa
Flow cytometer software	BD Biosciences	FACSDiva
Flow cytometry analysis software	BD Biosciences	FlowJo
Hoechst33342	Sigma-Aldrich	B2261	bisBenzimide H 33342 trihydrochloride
Polystyrene round bottom test tube	CORNING	352054	12 x 75 mm, 5mL
Propidium iodide (PI)	Sigma-Aldrich	P4170	3,8-Diamino-5-[3-(diethylmethylammonio)propyl]-6-phenylphenanthridinium diiodide
Reserpine	Sigma-Aldrich	83580	(3β, 16β, 17α, 18β, 20α)-11,17-Dimethoxy-18-[(3,4,5-trimethoxybenzoyl)oxy]yohimban-16-carboxylic acid methyl ester
SKLB816	Provided by Dr. Shengyong Yang, Sichuan University
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Gibco	25200072
Verapamil hydrochloride	Sigma-Aldrich	V4629	5-[N-(3,4-Dimethoxyphenylethyl)methylamino]-2-(3,4-dimethoxyphenyl)-2-isopropylvaleronitrile hydrochloride