Analys av sidopopulation i solida tumör cellinjer
Summary
En bekväm, snabb och kostnadseffektiv metod för att mäta andelen sidopopulationsceller i solida tumör cellinjer presenteras.
Abstract
Cancerstamceller (CSCs) är en viktig orsak till tumörtillväxt, metastasering och återkommande. Isolering och identifiering av CSCs är av stor betydelse för tumör forskning. För närvarande används flera tekniker för identifiering och rening av CSCs från tumör vävnader och tumör cellinjer. Separation och analys av sidopopulationsceller (SP) är två av de vanliga metoderna. Metoderna förlitar sig på CSC: s förmåga att snabbt utvisa fluorescerande färgämnen, såsom Hoechst 33342. Färgämnets utflöde är förknippat med ATP-bindande kassett (ABC) transportörer och kan hämmas av ABC transportörhämmare. Metoder för färgning odlade tumörceller med Hoechst 33342 och analysera andelen av deras SP celler genom flöde cytometri beskrivs. Denna analys är bekväm, snabb och kostnadseffektiv. Data som genereras i denna analys kan bidra till en bättre förståelse av effekten av gener eller andra extracellulära och intracellulära signaler på tumörcellernas stamegenskaper.
Introduction
Cancerstamceller (CSCs) är delmängder av celler med självförnyelseförmåga och multipla differentieringspotential, som spelar en viktig roll i tumörtillväxt, metastasering och återkommande1,2. För närvarande har CSCs identifierats för att existera i en mängd maligna tumörer, inklusive lunga, hjärna, bukspottkörtel, prostata, bröstochlevercancer3,4,5,6,7,8,9. Identifiering av CSCs i dessa tumörer är huvudsakligen baserat på förekomsten av ytmarkörproteiner, såsom högt och/ eller lågt uttryck av CD44, CD24, CD133 och Sca-19,10, men en unik markör som kan skilja CSCs från icke-CSCs har hittills inte rapporterats. För närvarande används flera tekniker för att identifiera och rena CSCs i tumörvävnad eller tumör cellinjer. Dessa tekniker är utformade baserat på CSC:s specifika egenskaper. Bland dem är analyser och sortering av sidopopulationsceller (SP) två av de vanliga metoderna.
SP-celler upptäcktes ursprungligen av Goodell et al.11, när de karakteriserade hematopoetiska stamceller i musbenmärgsceller. När mus benmärg celler var märkta med fluorescerande färgämne Hoechst 33342, en liten grupp av Hoechst 33342 svagt färgade celler uppträdde i den tvådimensionella pricken plot av ett flöde cytometri analys. Hoechst 33342 är ett DNA-bindande färgämne och har minst två bindningslägen som leder till olika spektralegenskaper. När man tittar på fluorescensutsläpp vid två våglängder samtidigt kan flera populationer avslöjas12. I sin analys var Hoechst 33342 upphetsad på 350 nm och fluorescensen mättes med hjälp av filtret 450/20 nm bandpass (BP) och 675 nm kantfilter långpass (EFLP)11. Jämfört med hela populationen av benmärgsceller berikades denna grupp av celler med hematopoetiska stamceller som kallas SP-celler11. SP-celler kan snabbt utvisa Hoechst 33342. Utflödet av detta färgämne är relaterat till ATP-bindande kassett (ABC) transportörer13, som kan hämmas av vissa medel som Fumitremorgin C14,Verapamil och Reserpine15,16. Därefter upptäcktes olika proportioner av SP-celler i en mängd olika vävnader, organ, tumörvävnader och tumörcelllinjer17,18,19. Dessa SP-celler har många egenskaper hos stamceller17,19.
Detta manuskript beskriver Hoechst 33342 märkning och färgning av odlade tumörceller och analys av SP-celler genom flöde cytometri. Dessutom visas optimering av Hoechst 33342 koncentrationen och rätt blockerare urval för en specifik tumör cellinje med hjälp av detta tillvägagångssätt. Slutligen demonstreras effekterna av stamning marknadsföring eller hämning signaler på andelen SP i tumör celler. De experimentella exemplen visar att analys av SP kan användas för att utforska effekterna av olika signaler, såsom genuttryck, små hämmare, aktivatorer, cytokiner och kemokiner, på tumörstamhet. Jämfört med andra metoder för isolering och rening av CSCs, såsom sortering av CD44+/ CD24– population, aldehyd dehydrogenas (ALDH) analys och tumör sfärbildning analyser, är denna metod lättare för manipulation och är kostnadseffektiv.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det finns flera viktiga punkter att tänka på för SP-analysen. Den första är valet av en riktig blockerare, till exempel Verapamil eller Reserpine, för varje cellinje, eftersom SP-cellernas “gate” -plats bestäms enligt den position där ett stort antal SP-celler försvinner efter tillsats av blockeraren. För MDA-MB-231-cellinjen fungerar Reserpine bra. Men för andra cellinjer kan olika blockerare fungera bättre.
Den andra är koncentrationen av Hoechst 33342. Andelen SP-celler ökade …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete finansierades av Natural Science Foundation of China 81572599, 81773124 och 81972787; Naturvetenskapliga stiftelsen i Tianjin City (Kina) 19JCYBJC27300; Tianjin People’s Hospital & Nankai University Collaborative Research Grant 2016rmnk005; Grundforskningsfonder för de centrala universiteten, Nankai University 63191153.
Materials
| 6 well cell culture plate | CORNING | 3516 | 9.5 cm2 (approx.) |
| Colivelin | MCE | HY-P1061A | Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala-Pro-Ala-Gly-Ala-Ser-Arg-Leu-Leu-Leu-Leu-Thr-Gly-Glu-Ile-Asp-Leu-Pro |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biological Industries (BIOIND) | 04-001-1ACS | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | BD LSRFortessa | |
| Flow cytometer software | BD Biosciences | FACSDiva | |
| Flow cytometry analysis software | BD Biosciences | FlowJo | |
| Hoechst33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | bisBenzimide H 33342 trihydrochloride |
| Polystyrene round bottom test tube | CORNING | 352054 | 12 x 75 mm, 5mL |
| Propidium iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4170 | 3,8-Diamino-5-[3-(diethylmethylammonio)propyl]-6-phenylphenanthridinium diiodide |
| Reserpine | Sigma-Aldrich | 83580 | (3β, 16β, 17α, 18β, 20α)-11,17-Dimethoxy-18-[(3,4,5-trimethoxybenzoyl)oxy]yohimban-16-carboxylic acid methyl ester |
| SKLB816 | Provided by Dr. Shengyong Yang, Sichuan University | ||
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200072 | |
| Verapamil hydrochloride | Sigma-Aldrich | V4629 | 5-[N-(3,4-Dimethoxyphenylethyl)methylamino]-2-(3,4-dimethoxyphenyl)-2-isopropylvaleronitrile hydrochloride |
References
- Reya, T., Morrison, S. J., Clarke, M. F., Weissman, I. L. Stem cells, cancer, and cancer stem cells. Nature. 414 (6859), 105-111 (2001).
- Batlle, E., Clevers, H. Cancer stem cells revisited. Nature Medicine. 23 (10), 1124-1134 (2017).
- Eramo, A., et al. Identification and expansion of the tumorigenic lung cancer stem cell population. Cell Death & Differentiation. 15 (3), 504-514 (2008).
- Kahlert, U. D., et al. CD133/CD15 defines distinct cell subpopulations with differential in vitro clonogenic activity and stem cell-related gene expression profile in in vitro propagated glioblastoma multiforme-derived cell line with a PNET-like component. Folia Neuropathologica. 50 (4), 357-368 (2012).
- Bailey, J. M., et al. DCLK1 marks a morphologically distinct subpopulation of cells with stem cell properties in preinvasive pancreatic cancer. Gastroenterology. 146 (1), 245-256 (2014).
- Hurt, E. M., Kawasaki, B. T., Klarmann, G. J., Thomas, S. B., Farrar, W. L. CD44+ CD24(-) prostate cells are early cancer progenitor/stem cells that provide a model for patients with poor prognosis. British Journal of Cancer. 98 (4), 756-765 (2008).
- Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 100 (7), 3983-3988 (2003).
- Yang, Z. F., et al. Significance of CD90+ cancer stem cells in human liver cancer. Cancer Cell. 13 (2), 153-166 (2008).
- Schulenburg, A., et al. Cancer stem cells in basic science and in translational oncology: can we translate into clinical application. Journal of Hematology & Oncolcology. 8, 16 (2015).
- Park, J. W., Park, J. M., Park, D. M., Kim, D. Y., Kim, H. K. Stem Cells Antigen-1 Enriches for a Cancer Stem Cell-Like Subpopulation in Mouse Gastric Cancer. Stem Cells. 34 (5), 1177-1187 (2016).
- Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. Journal of Experimental Medicine. 183 (4), 1797-1806 (1996).
- Goodell, M. A. Stem cell identification and sorting using the Hoechst 33342 side population (SP). Current Protocols in Cytometry. , 18 (2005).
- Begicevic, R. R., Falasca, M. ABC Transporters in Cancer Stem Cells: Beyond Chemoresistance. International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2362 (2017).
- Rabindran, S. K., Ross, D. D., Doyle, L. A., Yang, W., Greenberger, L. M. Fumitremorgin C reverses multidrug resistance in cells transfected with the breast cancer resistance protein. 암 연구학. 60 (1), 47-50 (2000).
- Takara, K., et al. Differential effects of calcium antagonists on ABCG2/BCRP-mediated drug resistance and transport in SN-38-resistant HeLa cells. Molecular Medicine Reports. 5 (3), 603-609 (2012).
- Matsson, P., Pedersen, J. M., Norinder, U., Bergstrom, C. A., Artursson, P. Identification of novel specific and general inhibitors of the three major human ATP-binding cassette transporters P-gp, BCRP and MRP2 among registered drugs. Pharmaceutical Research. 26 (8), 1816-1831 (2009).
- Challen, G. A., Little, M. H. A side order of stem cells: the SP phenotype. Stem Cells. 24 (1), 3-12 (2006).
- Wu, C., Alman, B. A. Side population cells in human cancers. Cancer Letters. 268 (1), 1-9 (2008).
- Patrawala, L., et al. Side population is enriched in tumorigenic, stem-like cancer cells, whereas ABCG2+ and ABCG2- cancer cells are similarly tumorigenic. 암 연구학. 65 (14), 6207-6219 (2005).
- Yamada, M., et al. Nasal Colivelin treatment ameliorates memory impairment related to Alzheimer’s disease. Neuropsychopharmacology. 33 (8), 2020-2032 (2008).
- Marotta, L. L., et al. The JAK2/STAT3 signaling pathway is required for growth of CD44(+)CD24(-) stem cell-like breast cancer cells in human tumors. Journal of Clinical Investigation. 121 (7), 2723-2735 (2011).
- Zhang, C. H., et al. From Lead to Drug Candidate: Optimization of 3-(Phenylethynyl)-1H-pyrazolo[3,4-d]pyrimidin-4-amine Derivatives as Agents for the Treatment of Triple Negative Breast Cancer. Journal of Medicnal Chemistry. 59 (21), 9788-9805 (2016).
- Tam, W. L., et al. Protein kinase C alpha is a central signaling node and therapeutic target for breast cancer stem cells. Cancer Cell. 24 (3), 347-364 (2013).
- Ibrahim, S. F., Diercks, A. H., Petersen, T. W., van den Engh, G. Kinetic analyses as a critical parameter in defining the side population (SP) phenotype. Experimental Cell Research. 313 (9), 1921-1926 (2007).
- Petriz, J. Flow cytometry of the side population (SP). Current Protocol in Cytometry. , 23 (2013).
- Hiraga, T., Ito, S., Nakamura, H. Side population in MDA-MB-231 human breast cancer cells exhibits cancer stem cell-like properties without higher bone-metastatic potential. Oncology Reports. 25 (1), 289-296 (2011).
- Shen, W., et al. ICAM3 mediates inflammatory signaling to promote cancer cell stemness. Cancer Letters. 422, 29-43 (2018).
- Koh, S. Y., Moon, J. Y., Unno, T., Cho, S. K. Baicalein Suppresses Stem Cell-Like Characteristics in Radio- and Chemoresistant MDA-MB-231 Human Breast Cancer Cells through Up-Regulation of IFIT2. Nutrients. 11 (3), 624 (2019).
- Lee, H., Park, S., Kim, J. B., Kim, J., Kim, H. Entrapped doxorubicin nanoparticles for the treatment of metastatic anoikis-resistant cancer cells. Cancer Letters. 332 (1), 110-119 (2013).
- Ota, M., et al. ADAM23 is downregulated in side population and suppresses lung metastasis of lung carcinoma cells. Cancer Science. 107 (4), 433-443 (2016).
- Wei, H., et al. The mechanisms for lung cancer risk of PM2.5 : Induction of epithelial-mesenchymal transition and cancer stem cell properties in human non-small cell lung cancer cells. Environmental Toxicology. 32 (11), 2341-2351 (2017).
- Prasanphanich, A. F., White, D. E., Gran, M. A., Kemp, M. L. Kinetic Modeling of ABCG2 Transporter Heterogeneity: A Quantitative, Single-Cell Analysis of the Side Population Assay. PLoS Computational Biology. 12 (11), 1005188 (2016).
- Han, H., et al. An endogenous inhibitor of angiogenesis inversely correlates with side population phenotype and function in human lung cancer cells. Oncogene. 33 (9), 1198-1206 (2014).
- Loebinger, M. R., Sage, E. K., Davies, D., Janes, S. M. TRAIL-expressing mesenchymal stem cells kill the putative cancer stem cell population. British Journal of Cancer. 103 (11), 1692-1697 (2010).
- Chiba, T., et al. Side population purified from hepatocellular carcinoma cells harbors cancer stem cell-like properties. Hepatology. 44 (1), 240-251 (2006).
- Hirschmann-Jax, C., et al. A distinct “side population” of cells with high drug efflux capacity in human tumor cells. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 101 (39), 14228-14233 (2004).
- Chen, A. Y., Yu, C., Gatto, B., Liu, L. F. DNA minor groove-binding ligands: a different class of mammalian DNA topoisomerase I inhibitors. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 90 (17), 8131-8135 (1993).
