Summary
Se proporciona un protocolo para la inducción de la eritosis, muerte celular programada en eritrocitos, utilizando el ionóforo de calcio, ionomicina. La eriptosis exitosa se evalúa mediante el seguimiento de la fosfatidilserina de localización en el prospecto externo de la membrana. Se han examinado los factores que afectan al éxito del protocolo y se han proporcionado condiciones óptimas.
Abstract
La eriftosis, muerte celular programada por eritrocitos, ocurre en una serie de enfermedades hematológicas y durante la lesión de eritrocitos. Un sello distintivo de las células eriptóticas es la pérdida de asimetría compositiva de la membrana celular, lo que conduce a la translocación de fosfatidilserina al prospecto externo de la membrana. Este proceso se desencadena por el aumento de la concentración intracelular de Ca2+,que activa la escramblasa, una enzima que facilita el movimiento bidireccional de los fosfolípidos entre los foliolos de membrana. Dada la importancia de la eritosis en diversas condiciones enfermas, ha habido esfuerzos para inducir la eritosis in vitro. Tales esfuerzos han confiado generalmente en el ionóforo de calcio, ionomicina, para mejorar la concentración intracelular de Ca2+ e inducir la eritosis. Sin embargo, muchas discrepancias se han divulgado en la literatura con respecto al procedimiento para inducir la eritosis usando ionomicina. Aquí, reportamos un protocolo paso a paso para la eritosis inducida por ionomicina en eritrocitos humanos. Nos centramos en pasos importantes en el procedimiento, incluyendo la concentración de ionóforo, el tiempo de incubación y el agotamiento de la glucosa, y proporcionamos un resultado representativo. Este protocolo se puede utilizar para inducir reproduciblemente eritosis en el laboratorio.
Introduction
La muerte celular programada en eritrocitos, también conocida como eritosis, es común en muchas condiciones clínicas y trastornos hematológicos. La eritosis se asocia con la contracción celular y la pérdida de asimetría fosfolípido en la membrana plasmática celular1,2. La pérdida de asimetría resulta en la translocación de fosfatidilserina (PS), un lípido normalmente localizado en el prospecto interno3,4, al prospecto externo celular, que indica a los macrófagos a la fagocitosa y eliminar eritrocitos defectuosos5,6,7,8. Al final de la vida útil normal de los eritrocitos, la eliminación de células eriptóticas por macrófagos asegura el equilibrio de los eritrocitos en circulación. Sin embargo, en condiciones enfermas, como la enfermedad de las células falciformes y la talasemia9,10,11, eritosis mejorada puede resultar en anemia grave2. Debido a su importancia en las enfermedades hematológicas, existe un interés significativo en examinar los factores que inducen o inhiben la eritosis y los mecanismos moleculares subyacentes a este proceso.
La membrana plasmática de eritrocitos sanos es asimétrica, con diferentes fosfolípidos localizando en los foliolos externos e internos. La asimetría de la membrana se regula principalmente por la acción de las enzimas de membrana. El translocase de aminofosfolípidos facilita el transporte de aminofosfolípidos, PS y fosfatidiletanolamina (PE), dirigiendo estos lípidos al prospecto interno celular. Por otro lado, floppase transporta la colina que contiene fosfolípidos, fosfatidilcolina (PC) y esfingomielina (SM), desde el interior hasta el foliolo exterior de la membrana celular12. Sin embargo, a diferencia de las células sanas, la membrana de los eritrocitos erifóticos está revuelta. Esto se debe a la acción de una tercera enzima, la escramblasa, que interrumpe la asimetría fosfolípido facilitando el transporte bidireccional de los aminofosfolípidos13,14,15,16. Scramblase se activa por niveles intracelulares elevados de Ca2+. Por lo tanto, los ionoforos de calcio, que facilitan el transporte de Ca2+ a través de la membrana celular12,son inductores eficientes de la eriptosis.
La ionomicina, un ionóforo de calcio, ha sido ampliamente utilizada para inducir la eritosis en eritrocitos12,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26. La ionomicina tiene grupos hidrófilos e hidrófobos, que son necesarios para unir y capturar el ion Ca2+, y transportarlo al espacio citosólico27,28,29. Esto conduce a la activación de la scramblasa y la translocación de PS al prospecto exterior, que se puede detectar fácilmente utilizando annexin-V, una proteína celular con una alta afinidad a PS12. Aunque la activación de la eritosis por ionomicina se divulga comúnmente, hay una considerable discrepancia de método en la literatura (Tabla 1). La población de eritrocitos sometidos a eriptosis depende de diferentes factores como la concentración de ionóforos, el tiempo de tratamiento con ionóforo y el contenido de azúcar del entorno extracelular (el agotamiento de la glucosa activa los canales catiónicos y facilita la entrada de Ca2+ en el espacio citosólico)30,31. Sin embargo, hay poca consistencia en estos factores en la literatura, lo que dificulta la realización de eritosis reproduciblemente in vitro.
En este protocolo, presentamos un procedimiento paso a paso para inducir la eritosis en eritrocitos humanos. Se examinan los factores que afectan a la eriptosis exitosa, como la concentración de Ca2+, la concentración de ionoforres, el tiempo de tratamiento y la preincubación en el tampón agotado de glucosa y se notifican valores óptimos. Este procedimiento demuestra que la preincubación de eritrocitos en un tampón libre de glucosa aumenta significativamente el porcentaje de eritosis en comparación con el tampón que contiene glucosa. Este protocolo se puede utilizar en el laboratorio para producir eritrocitos eriptóticos para diversas aplicaciones.
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Protocol
Todas las muestras de sangre humana utilizadas en el protocolo descrito a continuación se compraron como muestras no identificadas. Ningún sujeto humano estuvo directamente involucrado o reclutado para este estudio. Las directrices de la Declaración de Helsinki deben utilizarse cuando la investigación involucre a sujetos humanos.
1. Aislamiento de eritrocitos de sangre entera
- Añadir 500 l de sangre entera en citrato ácido dextrosa (ACD) (almacenado a 4 oC) a un tubo de microcentrífuga.
NOTA: Se compró sangre entera en aCD. Según la empresa, 1,5 ml de ACD se añade a 7 ml de sangre entera (8,5 ml de volumen total). - Centrifugar toda la sangre a 700 x g durante 5 min a temperatura ambiente (RT) y eliminar el plasma transparente y la capa fina y ligera con una pipeta para dejar la capa roja de eritrocitos.
- Preparar 1 L de solución de Ringer que contenga 125 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgSO4, 32 mM HEPES, 5 mM de glucosa y 1 mM de CaCl2. Ajuste el pH a 7,4 añadiendo 2 gotas de 1,0 M De NaOH. Para preparar la solución de Ringer sin glucosa, siga el mismo protocolo, pero no incluya glucosa en la solución.
- Lavar los eritrocitos 2x en solución Ringer suspendiendo el pellet celular en 1,5 ml de solución de Ringer, centrifugando a 700 x g durante 5 min en RT, y retirando el sobrenadante.
- Hacer un hematocrito al 0,4% resuponiendo 40 l del pellet de eritrocitos en 9.960 ml de solución de timbre libre de glucosa para alcanzar un volumen final de 10 ml.
NOTA: Hematocrito es un término utilizado para referirse a la fracción de volumen de eritrocitos en suspensión. Un hematocrito del 0,4% es una suspensión que contiene 0,4% de eritrocitos. - Incubar la suspensión celular a 37oC durante 7 días.
2. Tratamiento de eritrocitos con ionomicina y medición de la hemólisis
- Disolver 1 mg de sal de calcio de ionomicina en 630 ml de dimetilsulfóxido (DMSO) para alcanzar una concentración final de 2 mM. Aliquot y almacenar a -20oC.
- Tomar 1 mL del hematocrito al 0,4% del paso 1,5 y añadir 0,5 ml de ionomicina de 2 mM para alcanzar una concentración final de 1 M. Incubar durante 2 h a 37oC.
- Utilice 1 ml del hematocrito sin tratamiento con ionomicina como control negativo.
- Centrifugar los hematocritos tratados con ionomicina y no tratados a 700 x g durante 5 min en RT, y retire sus sobrenadores para dejar los gránulos celulares en la parte inferior de los tubos.
- Lave las células 3 veces con la solución Ringer suspendiendo los pellets celulares en 1,5 ml de solución Ringer, centrifugando a 700 x g durante 5 min a RT y descartando los sobrenatodores.
- Para medir la hemólisis, añadir 1 ml del hematocrito no tratado 0,4% del paso 1,5 a un tubo de microcentrífuga e incubar durante 2 h a 37 oC como control negativo para la hemólisis (0%).
- Añadir 1 ml del hematocrito no tratado 0,4% del paso 1,5 a un tubo de microcentrífuga y centrífuga a 700 x g durante 5 min a RT. Retire el sobrenadante y agregue 1 ml de agua destilada al pellet celular e incubar durante 2 h a 37 oC como control positivo para la hemólisis (100%).
- Añadir 1 ml del hematocrito de la ionomicina tratada con 0,4% del paso 2.2 a un tubo de microcentrífuga.
- Centrifugar las células no tratadas, las células tratadas y las células en agua destilada a 700 x g durante 5 min a RT.
- Tome 200 s de los supernatantes y agréguelos a una placa de 96 pocillos.
- Mida la absorbancia a 541 nm utilizando un lector de microplacas.
- Calcular la hemólisis usando la Ecuación 132:
%Hemolisis (AT - A0)/(A100 - A0)*100
donde A0 es la absorbancia de eritrocitos en la solución de Ringer, A100 es la absorción de eritrocitos en el agua, y UnaT es la absorción de eritrocitos tratados por ionomicina.
3. Ensayo vinculante Anexo-V
- Diluir 2 ml del búfer de unión V de 5x annexin en 8 ml de solución salina con fosfato (PBS) para obtener 1 búfer de unión.
- Resuspenda los gránulos celulares tratados con ionomicina y no tratados del paso 2.4 en 1 ml de búfer de unión 1x.
- Tomar 235 l de las suspensiones celulares en el tampón de unión y añadir 15 l de conjugado Annexin V-Alexa Flour 488.
- Incubar las células a RT durante 20 minutos en un lugar oscuro. Centrífuga a 700 x g durante 5 min en RT y retire el sobrenadante.
- Lavar las células 2x con 1x tampón de unión, suspendiendo el pellet celular en 1,5 ml del tampón de unión, centrifugando a 700 x g durante 5 min en RT y retirando el sobrenadante.
- Resuspenda los gránulos celulares en 250 ml de búfer de unión de 1x para mediciones de citometría de flujo.
4. Citometría de flujo
- Transfiera 200 ml de los eritrocitos teñidos annexin-V a tubos de poliestireno de fondo redondo de 1 ml compatibles con la citometría de flujo.
- Inicie sesión en el software de citometría de flujo y haga clic en el nuevo botón de experimento. Haga clic en el nuevo botón de tubo. Seleccione la hoja global y elija el análisis de aplicación para medir la intensidad de la fluorescencia con una longitud de onda de excitación de 488 nm y una longitud de onda de emisión de 530 nm.
- Establezca el número de células en 20.000 que se recogerán para el análisis de clasificación de células activada por fluorescencia (FACS).
- Seleccione el tubo deseado y haga clic en el botón de carga. Haga clic en el botón de registro para mediciones de dispersión hacia delante y dispersión lateral. Repita el proceso para todas las muestras.
- Haga clic derecho en el botón de la muestra y haga clic en aplicar el análisis por lotes para generar el archivo de resultados.
- Haga clic derecho en el botón de la muestra y haga clic en generar archivos FSC.
- Agregue los datos de citometría de flujo (archivos FSC) al lugar de trabajo del software de citometría de flujo.
- Analice los datos de control seleccionando la población celular de interés y agregando estadísticas para el valor de eritosis.
- Haga doble clic en el control y seleccione el histograma frente a la intensidad de la fluorescencia.
- Haga clic en el botón de puerta para dibujar una puerta en el histograma que indica el porcentaje de eritosis.
- Aplique las mismas estadísticas para todos los demás tubos experimentales para obtener los valores de eritosis. Haga clic con el botón derecho en el control y seleccione copiar análisis para agrupar.
- Después de hacer correctamente todas las muestras, transfiera los datos analizados arrastrándolos y soltándolos en el editor de diseño.
- Superponer los datos analizados con control en el editor de diseño.
- Establezca los histogramas e intensidades deseados cambiando los ejes x e y de los gráficos superpuestos.
- Exporte archivos de imagen haciendo clic en el botón de exportación y guarde los gráficos en la ubicación deseada.
5. Microscopía confocal
- Transfiera 5 l de células teñidas anexión en V en una diapositiva del microscopio y cúbrala con un resbalón de la cubierta. Mantener en un lugar oscuro para evitar el fotoblanqueo.
- Utilice el láser de argón del microscopio de fluorescencia confocal para observar las células excitadas a 488 nm con las ampliaciones deseadas.
NOTA: No es necesariamente necesario un microscopio confocal y cualquier microscopio con capacidades de fluorescencia se puede utilizar para obtener imágenes de fluorescencia que demuestren la unión anexión-V. - Obtener imágenes de fluorescencia del control (células no tratadas) y células tratadas.
NOTA: Se espera que las células no tratadas muestren señales de fluorescencia muy débiles, mientras que se espera que las células tratadas muestren fluorescencia verde brillante en sus membranas.
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Representative Results
Optimización de la concentración de ionomicina
Mientras que la ionomicina es necesaria para inducir la eritosis, el aumento de las concentraciones de ionomicina puede conducir a la hemólisis (es decir, lisis de eritrocitos y liberación de hemoglobina), que debe evitarse. El tratamiento de los eritrocitos con 1 M de ionomicina en solución de timbre durante 2 h es suficiente para inducir la eritosis, como lo demuestra el etiquetado exitoso con la quinua de Alexa Flour 488 anexa-V y la cuantificación mediante el análisis FACS(Figura 1A). Las concentraciones más altas de ionomicina (5 y 10 m) dan como resultado un ligero aumento de la eritosis(Figura 1A-D). Sin embargo, tales concentraciones también mejoran la hemólisis(Figura 1E),que no se desea. Con el fin de mantenerse por debajo del 5% de hemólisis, se debe utilizar 1 m de ionomicina.
Tiempo de tratamiento con ionomicina
Incubación de eritrocitos con ionomicina en solución de timbre durante tan solo 30 min es suficiente para inducir la eritosis (Figura 2A). El aumento del tiempo de incubación aumenta el nivel de eritosis, medido por el ensayo anexo en V, hasta 2 h(Figura 2B,C). Sin embargo, el tiempo de incubación adicional resulta en una ligera disminución en el nivel de eritosis(Figura 2D). La eriptosis máxima se obtuvo después de 2 h de tratamiento con 1 M de ionomicina, y para todos los demás tiempos de tratamiento, se obtuvo una eriptosis más baja(Figura 2E). Los histogramas de citometría de flujo representativos se presentan en la Figura 2A-D. Además, el porcentaje medio de eritosis y hemólisis, para diversos tiempos de tratamiento con 1 m de ionomicina, se presentan en la Figura 2E y la Figura 2F, respectivamente. El mayor valor de la hemólisis después de 180 min explica la reducción de la eritosis después de la misma cantidad de incubación(Figura 2E)ya que existen células menos viables a los 180 minutos de tratamiento con ionomicina.
Además, las células se trataron con bajas concentraciones de ionomicina, incluyendo 0, 0,25, 0,5 y 1 M para tiempos de tratamiento más largos, incluidos 6 y 12 h, y se midió la eritosis(Figura 3). Las células tratadas con concentraciones de ionomicina de menor esa 1 M durante 6 y 12 h muestran una erimptosis más baja en comparación con las células tratadas con 1 m de ionomicina(Figura 3). Dado que la disminución de la concentración y el aumento del tiempo de exposición no mejoraron la eritosis, se utilizó 1 M para desencadenar la eriptosis.
La eriptosis depende del tiempo de incubación y de la concentración de glucosa extracelular
La concentración extracelular de glucosa afecta el resultado del proceso. Se observan valores más altos de eritosis cuando los eritrocitos se preincuban en solución de Ringer libre de glucosa en comparación con la solución de Ringer que contiene glucosa antes de la incubación con 1 m de ionomicina durante 2 horas. Los valores más altos de eritosis se obtienen después de 7 días de pre-incubación en ambas soluciones. Sin embargo, la eritosis es mayor después de la preincubación en la solución de Ringer libre de glucosa en comparación con la solución normal de Ringer, que contiene glucosa de 5 mM (ver Figura 4A para parcelas representativas y Figura 4B para la comparación de medios globales). Además, los histogramas de dispersión hacia delante indican el efecto del agotamiento de la glucosa en la contracción de los eritrocitos(Figura 5A-D). La dispersión hacia delante es una medida para el tamaño de celda en función de la refracción de la luz, y el nivel de luz dispersa es directamente proporcional al tamaño de las celdas33. Las células incubadas en solución Ringer libre de glucosa muestran menos dispersión hacia adelante en comparación con las células incubadas en tampón que contiene glucosa(Figura 5E),lo que indica la contracción celular en el entorno libre de glucosa.
Además de las mediciones de citometría de flujo, se observaron células bajo un microscopio de fluorescencia confocal para confirmar la eriptosis. Los eritrocitos sin tratamiento(Figura 6A)y con tratamiento con ionomicina(Figura 6B)fueron etiquetados con conjugado conjugado conjugado alexa 488 anexo-V y observados bajo microscopio. Las células tratadas mostraron una señal de fluorescencia brillante(Figura 6B)debido a la unión de la anexión-V al PS en el prospecto exterior. Por el contrario, las células sin tratamiento mostraron una señal de fluorescencia muy débil(Figura 6A)que indica una eriptosis muy baja. En la Figura 6Cse muestran más imágenes de ejemplos de eritrocitos erifóticos etiquetados con annexin-V con señal de fluorescencia alta.
Figura 1: Gráficos representativos del efecto de varias concentraciones de ionomicina en la eritosis y la hemólisis. Histogramas de citometría de flujo de eritrocitos tratados con (A) 1 M, (( B) 5 m, y (C) 10 m ionomicina (gris) a 37 oC a 0,4% de hematocrito en la solución de timbre durante 2 h. La línea negra indica células no tratadas. El porcentaje de eritosis se indica en cada figura. La exposición a fosfatidilserina se midió utilizando unión annexina-V. (D) Aritmética significa sd (n a 3) del porcentaje de eritosis de las células tratadas con diferentes concentraciones de ionomicina después de 2 h de tratamiento, y (E) significa SD (n a 3) de hemolisis de eritrocitos por diferentes concentraciones de ionomicina en las mismas condiciones. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Cifras representativas sobre el efecto de varios tiempos de tratamiento de la ionomicina en la eritosis. Histogramas de citometría de flujo de eritrocitos tratados con 1 m de ionomicina (gris) a 37 oC para (A) 30 min, (B) 60 min, (C) 120 min y (D) 180 min a 0,4% de hematocrito en la solución de Ringer. La línea negra indica las células no tratadas. El porcentaje de eritosis se indica en cada figura. La exposición a fosfatidilserina se midió mediante la unión annexina-V. (E) Aritmética significa sd (n a 3) de eritosis porcentual de las células tratadas con 1 m de ionomicina para diferentes tiempos. La eriptosis más alta se obtuvo después de 120 min de tratamiento. (F) Aritmética significa sd (n a 3) de porcentaje de hemólisis de células tratadas con 1 m de ionomicina para diferentes tiempos. Para el análisis estadístico, se realizó ANOVA unidireccional no paramétrico con la prueba Kruskal-Wallis, y la eritosis después de 120 min el tratamiento fue significativamente mayor que el control indicado en el panel E. * es para p < 0.05. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Efecto de varias concentraciones de ionomicina y tiempos de tratamiento en la eritosis. Medios aritméticos: después de varios tiempos de tratamiento se muestra la ERitosis porcentual de las células tratadas con diferentes concentraciones de ionomicina. Las células fueron tratadas con bajas concentraciones de ionomicina incluyendo 0, 0,25, 0,5 y 1 m para una exposición más larga (6 h y 12 h). Las concentraciones más altas y los tratamientos más largos dieron lugar a valores más altos de eritosis. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Efecto del agotamiento de la energía en la eritosis. (A) Histograma de citometría de flujo para eritrocitos tratados con 1 m de ionomicina (gris) a 37 oC durante 2 h a un hematocrito al 0,4%, después de la preincubación en la solución de timbre libre de glucosa (cifras superiores) y la solución de timbre (cifras inferiores) de 1 a 7 días, revela que el agotamiento de la energía facilita la eritoptosis. La línea negra indica las células no tratadas. Los porcentajes de eritosis se indican en los gráficos de cada día. (B) Aritmética significa sd (n a 3) del porcentaje de eritosis de eritrocitos tratados con 1 ocitincina a 37 oC durante 2 h a un hematocrito al 0,4%, después de la preincubación en la solución de Ringer (barras negras) y la solución de timbre libre de glucosa (barras blancas) de 1 a 7 días. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Efecto del agotamiento de la energía en el tamaño de la célula. histograma de dispersión hacia delante para eritrocitos tratados con ionomicina de 1 M a 37 oC durante 2 h a un hematocrito al 0,4%, después de la preincubación en la solución de Ringer libre de glucosa (gris) y la solución de timbre (línea negra) durante (A) 1 día, (B) 3 días, (C) 5 días, y (D) 7 días. El histograma de dispersión hacia delante a lo largo del tiempo indica contracción de eritrocitos en el búfer libre de glucosa. (E) Aritmética significa sd (n a 3) de intensidades de dispersión hacia delante de eritrocitos tratados con 1 oC de ionomicina a 37 oC durante 2 h a un hematocrito al 0,4%, después de la preincubación en la solución De ringer (barras negras) y la solución de timbre libre de glucosa (barras blancas) de 1 a 7 días. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Imágenes de microscopía de fluorescencia confocal de eritrocitos tratados con (A) 0 M, (B) y (C) 1 ominomicina a 37 oC durante 2 h a 0,4% de hematocrito. Se utilizó un aumento objetivo de 40x para imágenes en los paneles A y B, y se utilizó un aumento objetivo 100x para tomar imágenes para el panel C. PS en eritrocitos sanos se encuentra en el prospecto interno de la membrana celular, por lo tanto no hay señal de fluorescencia en el panel A. En los paneles B y C se han inducido eritrocitos para la eritosis y hay una señal de fluorescencia brillante resultante de la unión de annexin-V a PS translocado al prospecto externo de la membrana celular. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Densidad celular /hematocrit | Concentración de ionomicina | Búfer | Pre-incubación | Tiempo de tratamiento con ionomicina | Método de detección | Referencia |
| 1.65 x 108 células/ml | 0,3 mM | Búfer A* | 36 h en el tampón A | 1 h | Anexo V | 12 |
| 0.40% | 1 mM | Solución ringer | 48 h en Ringer | 1 h | Anexo V | 17 |
| 50% | 10 mM | Búfer B** | - | 3 h | Merocyanina 540 | 18 |
| 0.40% | 1 mM | Solución ringer | 48 h en Ringer | 1 h | Anexo V | 19 |
| 0.40% | 1 mM | Solución ringer | 48 h en Ringer | 1 h | Anexo V | 20 |
| 2% | 1 mM | Solución ringer | - | 4 h | Anexo V | 21 |
| 0.40% | 1 mM | Solución ringer | - | 0,5 h | Anexo V | 22 |
| 10% | 1 mM | Solución ringer | - | 3 h | Anexo V | 23 |
| 0.40% | 10 mM | Solución ringer | - | 0,5 h | Anexo V | 24 |
| 0.40% | 1 mM | Solución ringer | 48 h en Ringer | 0,5 h | Anexo V | 25 |
| 2 x 106 celdas/ml | 1 mM | Solución salina con búfer HEPES (HBS) | - | 0,5 h | Anexo V | 26 |
| *Buffer A: 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl26H2O, 10 mM de glucosa, y 1,8 mM CaCl22H2O | ||||||
| **Buffer B: 5 mM Tris, 100 mM KC1, 60 mM NaCl y 10 mM de glucosa | ||||||
Tabla 1: Varios protocolos utilizados en la literatura para inducir la eritosis usando ionomicina.
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Discussion
El objetivo de este procedimiento es proporcionar valores óptimos para la concentración de ionóforo, el tiempo de tratamiento y la concentración de glucosa extracelular, que son factores importantes para garantizar la inducción exitosa de la eritosis. Un paso crítico en el protocolo es el agotamiento de la glucosa extracelular, que, a pesar de su importancia, no ha sido suficientemente enfatizado en la literatura. El contenido de azúcar en la solución normal de Ringer (5 mM) tiene un efecto inhibitorio sobre la eritosis. El agotamiento de la glucosa en el entorno extracelular induce el estrés celular y activa la proteína quinasa C (PKC), lo que resulta en la activación de los canales de calcio y potasio. Esto se traduce en un aumento en la entrada de Ca2+ en el espacio citosólico30,31,34 y en última instancia activa la scramblase16,lo que aumenta la eritosis. La activación del canal de potasio también resulta en fuga de cloruro de potasio fuera de la célula, lo que conduce a la contracción de eritrocitos35.
El procedimiento descrito anteriormente debe realizarse con atención específica a la hemólisis. Es importante utilizar una concentración de ionóforo optimizado, que es lo suficientemente alta como para inducir la eritosis, y lo suficientemente baja como para prevenir la hemólisis. Del mismo modo, la incubación de eritrocitos con ionomicina durante un corto período de tiempo da como resultado una eritosis baja, mientras que la incubación muy larga puede conducir a la interrupción de la membrana celular y la hemólisis. También debe tenerse en cuenta que mientras que el protocolo presentado es altamente confiable cuando se realiza en la misma muestra de eritrocitos, las células de diferentes individuos responden de manera diferente a la ionomicina y puede haber variabilidad entre sujetos entre diferentes muestras.
Se debe prestar especial atención al análisis de datos de la citometría de flujo. El porcentaje de eritosis obtenida del citómetro de flujo indica el porcentaje de población celular con PS en su prospecto externo. Sin embargo, las células con diferentes intensidades de unión annexin-V no se pueden distinguir en función de este número. Annexin-V se une al PS expuesto en la superficie celular, con una afinidad muy alta y alta especificidad a PS36,37,38. Sin embargo, como se muestra en las imágenes de microscopía de este informe, diferentes células muestran diferencias en la intensidad de unión annexin-V. Las células con PS baja en sus membranas tienen bajas intensidades de fluorescencia, mientras que una mayor ocupación de PS en la membrana celular da como resultado intensidades de fluorescencia más altas.
El protocolo presentado en este documento se puede modificar aumentando la concentración extracelular De Ca2+. En este protocolo, se utilizó ionomicina para inducir la eritosis en presencia de 1 mM De CaCl2; concentraciones más altas de Ca2+ pueden conducir a niveles más altos de calcio intracelular y pueden inducir más eriptosis. Además, diferentes ionoforos de calcio, como selectóforo y calcimicina, podrían tener una capacidad diferente para mejorar la concentración intracelular de Ca2+,en comparación con la ionomicina, y podrían dar lugar a diferentes valores de eritosis. Sin embargo, la eriptosis consistente de los eritrocitos se puede lograr utilizando ionomicina con el protocolo descrito y se puede utilizar en el laboratorio para examinar los mecanismos moleculares de la eritosis, imitar las condiciones enfermas39,40in vitro,y la pantalla terapéutica potencial que inhibe la eritosis, entre otras aplicaciones.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la concesión NIH R15ES030140 y la concesión NSF CBET1903568. También se reconoce el apoyo financiero del Russ College of Engineering and Technology y del Departamento de Ingeniería Química y Biomolecular de la Universidad de Ohio.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well plate | Fisher Scientific | 12-565-331 | |
| Annexin V Alexa Fluor 488 - apoptosis kit | Fisher Scientific | A10788 | Store at 4 °C |
| BD FACSAria II flow cytometer | BD Biosciences | 643177 | |
| CaCl2 | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Centrifuge | Millipore Sigma | M7157 | Model Eppendorf 5415C |
| Confocal fluorescence microscopy | Zeiss, LSM Tek Thornwood | Model LSM 510, Argon laser excited at 488 nm for taking images | |
| Cover glasses circles | Fisher Scientific | 12-545-100 | |
| Disposable round bottom flow cytometry tube | VWR | VWRU47729-566 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 472301-100ML | |
| DPBS | VWR Life Science | SH30028.02 | |
| Glucose monohydrate | Sigma-Aldrich | Y0001745 | |
| HEPES Buffer (1 M) | Fisher Scientific | 50-751-7290 | Store at 4 °C |
| Ionomycin calcium salt | EMD Milipore Corp. | 407952-1MG | Dissolve in DMSO to reach 2 mM. Store at -20 °C |
| KCl | Fisher Scientific | P330-500 | |
| MgSO4 | Fisher Scientific | M65-500 | |
| Microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 02-681-5 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Plain glass microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-4 | |
| Synergy HFM microplate reader | BioTek | ||
| Whole blood in ACD | Zen-Bio | Store at 4 °C and warm to 37 °C prior to use |
References
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