Induktion af Eryptose i røde blodlegemer ved hjælp af en calcium Ionophore

Summary

En protokol til induktion af eryptose, programmeret celledød i erythrocytter, ved hjælp af calcium ionophore, ionomycin, er tilvejebragt. Vellykket eryptose evalueres ved at monitorere lokaliseringen phosphatidylserin i membranen ydre folder. Faktorer, der påvirker protokollens succes, er blevet undersøgt, og de optimale betingelser er opfyldt.

Abstract

Eryptose, erythrocyt programmeret celledød, forekommer i en række hæmatologiske sygdomme og under skade på erythrocytter. Et kendetegn for eryptotiske celler er tabet af kompositoriske asymmetri af cellemembranen, hvilket fører til translokation af phosphatidylserin til membranens ydre folder. Denne proces udløses af øget intracellulær koncentration af ca^{2 +}, som aktiverer scramblase, et enzym, der letter tovejs bevægelse af phospholipider mellem membran foldere. I betragtning af eryptose betydning i forskellige sygdomstilstande, har der været bestræbelser på at inducere eryptose in vitro. Sådanne bestræbelser har generelt påberåbt sig calcium ionophore, ionomycin, at øge intracellulær ca^{2 +} koncentration og inducere eryptose. Men, mange uoverensstemmelser er blevet rapporteret i litteraturen om proceduren for inducerende eryptosis ved hjælp af ionomycin. Heri rapporterer vi en trin-for-trin-protokol for ionomycin-induceret eryptose i humane erythrocytter. Vi fokuserer på vigtige trin i proceduren, herunder ionophor koncentration, inkubationstid, og glukose udtømning, og give repræsentative resultat. Denne protokol kan anvendes til reproducerbart at inducere eryptose i laboratoriet.

Introduction

Programmeret celledød i erythrocytter, også kendt som eryptose, er almindeligt i mange kliniske tilstande og hæmatologiske lidelser. Eryptose er forbundet med celle svind og tabet af phospholipid asymmetri i cellen plasma membran^1,2. Tab af asymmetri resulterer i translokation af Phosphatidylserin (PS), en lipid normalt lokaliseret i den indre folder^3,4, til cellen ydre folder, som signalerer til makrofager til fagocytose og fjerne defekte erythrocytter^5,6,7,8. Ved afslutningen af den normale levetid af erythrocytter, fjernelse af eryptotiske celler ved makrofager sikrer balancen i erytrocytter i omløb. Men, i syge sygdomme, såsom seglcellesygdom og thalassæmi^9,10,11, øget eryptose kan resultere i svær anæmi². På grund af sin betydning for hæmatologiske sygdomme, er der betydelig interesse i at undersøge de faktorer, inducerende eller hæmme eryptose og de molekylære mekanismer underliggende denne proces.

Plasma membranen af sunde erythrocytter er asymmetrisk, med forskellige fosfolipider lokaliserer på de ydre og indre foldere. Membran asymmetri er primært reguleret af virkningen af membran enzymer. Aminophospholipid translocase letter transport af aminophospholipids, PS og phosphatidylethanolamin (PE), ved at dirigere disse lipiderne til cellens indre folder. På den anden side, floppase transporterer cholin indeholdende fosfolipider, phosphatidylcholin (PC) og sphingomyelin (SM), fra den indre til den ydre folder af cellemembranen¹². Men, i modsætning til raske celler, membranen af eryptotiske erythrocytter er forvrænget. Dette skyldes virkningen af et tredje enzym, scramblase, der forstyrrer fosfolipid asymmetri ved at lette tovejs transport af aminophospholipider^13,14,15,16. Scramblase aktiveres ved forhøjede intracellulære niveauer på ca^{2 +}. Derfor er calcium ionophorer, som letter transporten af ca^{2 +} på tværs af cellemembranen¹², effektive induktorer af eryptose.

Ionomycin, en calcium ionophore, har været almindeligt anvendt til at inducere eryptose i erytrocytter^{12,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26}. Ionomycin har både hydrofile og hydrofobe grupper, som er nødvendige for at binde og fange ca^{2 +} ion, og transportere det til cytosolisk rummet^27,28,29. Dette fører til aktivering af scramblase og translokation af PS til den ydre folder, som let kan påvises ved hjælp af bilagin-V, et cellulært protein med en høj affinitet til PS¹². Selv om det er almindeligt rapporteret, at ionomycin udløser eryptose, er der en betydelig metode uoverensstemmelse i litteraturen (tabel 1). Populationen af erythrocytter gennemgår eryptose afhænger af forskellige faktorer såsom ionophor koncentration, behandlingstid med ionophor, og sukkerindholdet i ekstracellulære miljø (glucosenedbrydning aktiverer kation kanaler og letter indtastning af ca^{2 +} ind i cytosolisk rummet)^30,31. Men, der er lidt konsistens i disse faktorer i litteraturen, gør det vanskeligt at udføre eryptosis reproducerbart in vitro.

I denne protokol præsenterer vi en trin-for-trin procedure for at inducere eryptose i humane erythrocytter. Faktorer, der påvirker vellykket eryptose, herunder ca^{2 +} koncentration, ionophor koncentration, behandlingstid, og præ-inkubation i glukose-depleteret buffer er undersøgt og optimale værdier rapporteres. Denne procedure viser, at præ-inkubation af erytrocytter i en glucosefri buffer øger procentdelen af eryptose i forhold til glucoseholdige buffer. Denne protokol kan anvendes i laboratoriet til at producere eryptotiske erythrocytter til forskellige anvendelser.

Protocol

Alle humane blodprøver, der anvendes i den nedenfor beskrevne protokol, blev købt som de identificerede prøver. Ingen forsøgspersoner var direkte involveret eller rekrutteret til denne undersøgelse. Retningslinjerne i Helsingfors-erklæringen bør anvendes, når forskningen involverer mennesker. 1. erythrocyt isolation fra fuldblod Der tilsættes 500 μL fuldblod i syre citrat dextrose (ACD) (opbevares ved 4 °C) til et mikrocentrifuge glas.Bemærk: fuldblod blev købt i ACD…

Representative Results

Optimering af ionomycin-koncentrationen Mens ionomycin er nødvendig for at inducere eryptose, kan forhøjede ionomycin koncentrationer føre til hæmolyse (dvs. lyse af erythrocytter og frigivelse af hæmoglobin), som skal undgås. Behandling af erytrocytter med 1 μM ionomycin i ringer løsning for 2 h er nok til at inducere eryptose, som det fremgår af vellykket mærkning med annexin-V Alexa mel 488 konjugat…

Discussion

Målet med denne procedure er at tilvejebringe optimale værdier for ionophor koncentration, behandlingstid og ekstracellulær glukose koncentration, som er vigtige faktorer for at sikre vellykket induktion af eryptose. Et kritisk skridt i protokollen er nedbrydningen af ekstracellulær glucose, som trods sin betydning ikke er blevet tilstrækkeligt understreget i litteraturen. Sukkerindholdet i normal ringe opløsning (5 mM) har en hæmmende virkning på eryptose. Glucosedepletering i det ekstracellulære miljø inducer…

Materials

96-well plate	Fisher Scientific	12-565-331
Annexin V Alexa Fluor 488 – apoptosis kit	Fisher Scientific	A10788	Store at 4 °C
BD FACSAria II flow cytometer	BD Biosciences	643177
CaCl2	Fisher Scientific	C79-500
Centrifuge	Millipore Sigma	M7157	Model Eppendorf 5415C
Confocal fluorescence microscopy	Zeiss, LSM Tek Thornwood		Model LSM 510, Argon laser excited at 488 nm for taking images
Cover glasses circles	Fisher Scientific	12-545-100
Disposable round bottom flow cytometry tube	VWR	VWRU47729-566
DMSO	Sigma-Aldrich	472301-100ML
DPBS	VWR Life Science	SH30028.02
Glucose monohydrate	Sigma-Aldrich	Y0001745
HEPES Buffer (1 M)	Fisher Scientific	50-751-7290	Store at 4 °C
Ionomycin calcium salt	EMD Milipore Corp.	407952-1MG	Dissolve in DMSO to reach 2 mM. Store at -20 °C
KCl	Fisher Scientific	P330-500
MgSO4	Fisher Scientific	M65-500
Microcentrifuge tube	Fisher Scientific	02-681-5
NaCl	Fisher Scientific	S271-500
Plain glass microscope slides	Fisher Scientific	12-544-4
Synergy HFM microplate reader	BioTek
Whole blood in ACD	Zen-Bio		Store at 4 °C and warm to 37 °C prior to use