Producción de partículas pseudotipadas de influenza infecciosa de alto valor con glicoproteínas envolventes de virus H5N1 altamente patógenos y aviares H7N9
Summary
Este protocolo describe un proceso experimental para producir partículas seudotipos virales infecciosas de alto valor (pp) con glicoproteínas envolventes de dos cepas de gripe A y cómo determinar su infectividad. Este protocolo es altamente adaptable para desarrollar pps de cualquier otro tipo de virus envueltos con diferentes glicoproteínas envolventes.
Abstract
La transmisión directa ocasional del virus de la gripe aviar A altamente patógeno H5N1 (HPAI H5N1) y H7N9 a los seres humanos y su letalidad son graves problemas de salud pública y sugieren la posibilidad de una epidemia. Sin embargo, nuestra comprensión molecular del virus es rudimentaria, y es necesario estudiar las propiedades biológicas de sus proteínas envolventes como dianas terapéuticas y desarrollar estrategias para controlar la infección. Desarrollamos una plataforma sólida de partículas pseudotipo virales (pp) para estudiar el virus de la gripe aviar, incluyendo el análisis funcional de su hemagglutinina (HA) y la neuraminidasa (NA) envuelve glicoproteínas, las características de reordenación de los HA y NA, receptores, tropismos, anticuerpos neutralizantes, diagnóstico, infectividad, con fines de desarrollo de fármacos y diseño de vacunas. Aquí, describimos un procedimiento experimental para establecer pps con las glicoproteínas envolventes (HA, NA) de dos cepas de gripe A (HAPI H5N1 y 2013 aviar H7N9). Su generación se basa en la capacidad de algunos virus, como el virus de la leucemia murina (MLV), para incorporar glicoproteínas de envoltura en un pp. Además, también detallamos cómo estos pps se cuantifican con RT-qPCR, y la detección de infectividad de pps de virus nativos y no coincidentes dependiendo del origen de los HA y NA. Este sistema es altamente flexible y adaptable y se puede utilizar para establecer pps virales con glicoproteínas envolventes que se pueden incorporar en cualquier otro tipo de virus envuelto. Por lo tanto, esta plataforma de partículas virales se puede utilizar para estudiar virus salvajes en muchas investigaciones de investigación.
Introduction
La misión de una partícula viral es transportar su genoma desde una célula huésped infectada a una célula huésped no infectada y entregarlo en el citoplasma o el núcleo en unformulario1 competente para la replicación. Este proceso se desencadena inicialmente por la unión a los receptores celulares del huésped, seguido por la fusión de virión y membranas celulares. Para los virus envueltos, como los virus de la gripe, las glicoproteínas de pico son responsables de la unión de receptores y la fusión1,2. Las glicoproteínas de sobrevirales (p. ej., pirógenos, antígenos), están implicadas en muchas propiedades y eventos importantes, como el inicio del ciclo de vida del virus (unión y fusión), la patogénesis viral, la inmunogenicidad, la apoptosis de células huésped y el tropismo celular, la vía endocytica celular, así como la transmisión y reordenación entre especies1,3,4,5,6,7. La investigación sobre las glicoproteínas de sobres virales nos ayudará a comprender muchos aspectos del proceso de infección viral. Las partículas virales pseudotipo (pp), también denominadas pseudoviriones o pseudopartículas, se pueden generar a través de una técnica de pseudotipado8,9,10. Esta tecnología se ha utilizado para desarrollar partículas pseudotipo de muchos virus, incluyendo hepatitis C11,12,hepatitis B13,virus de la estomatitis vesicular (VSV)14,15, y virus de la gripe16,17,18,19. Esta tecnología se basa en la proteína Gag-Pol de lentivirus u otros retrovirus.
Las partículas virales pseudotipo se pueden obtener utilizando un sistema de tres plásmidos mediante la cotransfección de un plásmido de expresión de glicoproteína enenvolvente viral, un plásmido de envase saqueviral que falta el gen envolvente env, y un plásmido reportero separado en células productoras de pp. El retrovirus se ensambla por su proteína Gag, y brota de una membrana celular infectada que expresa la proteína envolvente del virus1. Por lo tanto, es posible obtener pps de gripe de alto titer utilizando la proteína gag retrovirus para producir cogollos en una membrana celular que expresa la gripe HA y NA. En nuestros estudios anteriores, los HAs/NAs en todas las combinaciones eran funcionales y capaces de realizar sus correspondientes funciones en el ciclo de vida viral16,17,18,20,21. Estos pps se utilizan para investigar las características biológicas de la gripe, incluyendo la hemaglutinación, la actividad de la neuraminidasa, el tropismo de unión a los receptores HA e infectividad. Debido a que HA y NA son proteínas funcionales superficiales importantes en el ciclo de vida viral, los HA y NA no coincidentes derivados de diferentes cepas de gripe pueden demostrar en parte un reordenamiento entre ellos. Aquí, generamos ocho tipos de pps de gripe combinando dos ABA y dos NA (derivadas de la cepa HPAI H5N1 y la mancha H7N9), utilizando un sistema de pseudotipado de tres plásmidos. Estos ocho tipos de pps incluyen dos pps nativos, H5N1pp, H7N9pp; dos pps no coincidentes, (H5+N9)pp, (H7+N1)pp; y cuatro pps que sólo albergan una sola glicoproteína (HA o NA), H5pp, N1pp, H7pp, N9pp. Los estudios sobre el virus de la gripe, como H5N1 y H7N9, están limitados por los requisitos de bioseguridad. Todos los estudios de las cepas del virus de la gripe silvestre deben realizarse en un laboratorio de nivel 3 de bioseguridad (BSL-3). La tecnología de partículas virales pseudotipo se puede utilizar para empaquetar un virión artificial en un ajuste de nivel de bioseguridad 2 (BSL-2). Por lo tanto, pps representa una herramienta más segura y útil para estudiar los procesos del virus de la gripe dependiendo de sus dos principales glicoproteínas: la hemaglutinina (HA) y la neuraminidasa (NA).
Este protocolo describe la generación de estos pps con una estrategia de cofección de tres plásmdos (generalmente en la Figura 1),cómo cuantificar pps y detección de infectividad. La producción de pp implica tres tipos de plásmidos(Figura 1). El gen gag-pol, que codifica la proteína retrovirus Gag-Pol, fue clonado a partir de un kit de empaquetado de retrovirus e insertado en el plásmido pcDNA 3.1 y nombrado pcDNA-Gag-Pol. El gen mejorado de la proteína fluorescente verde (eGFP), que codifica la proteína fluorescente verde, fue clonado a partir del vector pTRE-EGFP, insertado en el plásmido pcDNA 3.1, y llamado pcDNA-GFP. Durante la clonación, se añadió una secuencia de señal de embalaje (o) a través de una imprimación. Los genes HA y NA fueron clonados en un plásmido pVRC, llamado pVRC-HA y pVRC-NA, respectivamente. El último plásmido codifica la proteína de fusión y puede ser reemplazado por cualquier otra proteína de fusión de interés. Nuestra plataforma de pseudotipado incluye dos plásmidos de expresión de glicoproteína: pVRC-HA y pVRC-NA. Esto puede simplificar la investigación sobre el resurtido entre diferentes cepas de virus en un entorno BSL-2.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este protocolo, describimos un método para producir partículas pseudotipo del virus de la gripe (pp) en un ajuste BSL-2. El reportero plásmido pcDNA-GFP se incorpora en el pps y se puede utilizar para cuantificar pps por FACS en un ensayo de infectividad. Elegimos dos tipos de líneas celulares susceptibles porque son ampliamente utilizadas en la investigación de la gripe. Las células MDCK proporcionarían un buen control a las células humanas inmortalizadas variables utilizadas en estos estudios.
<p class="…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Plan Provincial de Medicina y Ciencia y Tecnología de la Salud de Zhejiang (Números de subvención, 2017KY538), Hangzhou Municipal Medicine and Health Science and Technology Plan (Números de subvención, OO20190070), Hangzhou Medical Science y Proyecto clave tecnológico (Números de subvención, 2014Z11) y proyecto de aplicación autónoma municipal de Hangzhou de desarrollo social e investigación científica (Números de subvención, 20191203B134).
Materials
| Benzonase Nuclease | Millipore | 70664 | Effective viscosity reduction and removal of nucleic acids from protein solutions |
| Clear Flat Bottom Polystyrene TC-treated Microplates (96-well) | Corning | 3599 | Treated for optimal cell attachment Sterilized by gamma radiation and certified nonpyrogenic Individual alphanumeric codes for well identification |
| Clear TC-treated Multiple Well Plates (6-wells) | Costar | 3516 | Individual alphanumerical codes for well identification Treated for optimal cell attachment Sterilized by gamma irradiation |
| Dulbecco's modified essential medium (DMEM) | Gibco | 11965092 | A widely used basal medium for supporting the growth of many different mammalian cells |
| Fetal bovine serum | Excell | FND500 | fetal bovine sera that can offer excellent value for basic cell culture, specialty research, and specific assays |
| Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) | Beckman coulter | cytoflex | |
| Human alveolar adenocarcinoma A549 cells | ATCC | CRM-CCL-185 | |
| Human embryonic kidney (HEK) HEK-293T/17 cells | ATCC | CRL-11268 | A versatile transfection reagent that has been shown to effectively transfect the widest variety of adherent and suspension cell lines |
| Inverted fluorescent biological microscope | Olympus | BX51-32P01-FLB3 | |
| Inverted light microscope | Olympus | CKX31-12PHP | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668019 | Rapid, sensitive and precise probe-based qPCR detection and quantitation of target RNA targets. |
| Luna Universal Probe One-Step RT-qPCR Kit | NEB | E3006L | Will withstand up to 14,000 RCF RNase-/DNase-free Nonpyrogenic |
| Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cells | ATCC | CCL-34 | |
| MaxyClear Snaplock Microcentrifuge Tube (1.5 mL) | Axygen | MCT-150-C | 33 mm, gamma sterilized |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF | Millipore | SLHV033RS | an improved Minimal Essential Medium (MEM) that allows for a reduction of Fetal Bovine Serum supplementation by at least 50% with no change in cell growth rate or morphology. Opti-MEM I medium is also recommended for use with cationic lipid transfection reagents, such as Lipofectamine reagent. |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco | 11058021 | The antibiotics penicillin and streptomycin are used to prevent bacterial contamination of cell cultures due to their effective combined action against gram-positive and gram-negative bacteria. |
| penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | Maximum RCF is 12,500 xg Temperature range from -80 °C to 120 °C RNase-/DNase-free Sterile |
| PP Centrifuge Tubes (15 mL) | Corning | 430791 | a stable and highly reactive serine protease |
| Proteinase K | Beyotime | ST532 | Treated for optimal cell attachment Sterilized by gamma radiation and certified nonpyrogenic |
| TC-treated Culture Dish (60mm) | Corning | 430166 | Trypsin from bovine pancreas TPCK Treated, essentially salt-free, lyophilized powder, ≥10,000 BAEE units/mg protein |
| TPCK-trypsin | Sigma | T1426 | This liquid formulation of trypsin contains EDTA and phenol red. Gibco Trypsin-EDTA is made from trypsin powder, an irradiated mixture of proteases derived from porcine pancreas. Due to its digestive strength, trypsin is widely used for cell dissociation, routine cell culture passaging, and primary tissue dissociation. The trypsin concentration required for dissociation varies with cell type and experimental requirements. |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 |
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