Framställning av Högtiter infektiösa influensa Pseudotypade partiklar med kuvert glykoproteiner från högpatogen H5N1 och aviär H7N9 virus
Summary
Detta protokoll beskriver en experimentell process för att producera hög titer infektiösa virala pseudotypiserade partiklar (PP) med kuvert glykoproteiner från två influensa A stammar och hur man bestämmer deras smittsamhet. Detta protokoll är mycket anpassningsbar för att utveckla PPS av någon annan typ av höljeförsedda virus med olika kuvert glykoproteiner.
Abstract
Tillfällig direkt överföring av högpatogen aviär influensa A-virus H5N1 (HPAI H5N1) och H7N9 till människor och deras dödlighet är allvarliga folkhälsofrågor och tyder på en möjlighet till en epidemi. Men, vår molekylära förståelse av viruset är rudimentär, och det är nödvändigt att studera de biologiska egenskaperna hos dess kuvert proteiner som terapeutiska mål och att utveckla strategier för att kontrollera infektion. Vi utvecklade en solid viral pseudotypifierad partikel (PP) plattform för att studera aviär influensavirus, inklusive funktionell analys av dess hemagglutinin (HA) och neuraminidas (NA) kuvert glykoproteiner, omsortimenten egenskaperna hos har och NAs, receptorer, tropismer, neutraliserande antikroppar, diagnos, smittsamhet, för läkemedelsutveckling och vaccin design. Här beskriver vi ett experimentellt förfarande för att upprätta PPS med kuvertet glykoproteiner (HA, NA) från två influensa A-stammar (HAPI H5N1 och 2013 avian H7N9). Deras generation är baserad på kapaciteten hos vissa virus, såsom murina leukemi virus (MLV), att införliva kuvert glykoproteiner i en PP. Dessutom, vi detalj också hur dessa PPS kvantifieras med RT-qPCR, och smittsamhet upptäckt av infödda och inkompatibla virus PPS beroende på ursprunget av har och NAs. Detta system är mycket flexibelt och anpassningsbart och kan användas för att etablera viral PPS med kuvert glykoproteiner som kan införlivas i någon annan typ av höljeförsedda virus. Sålunda, denna viral partikel plattform kan användas för att studera vilda virus i många forsknings utredningar.
Introduction
Uppdraget för en viral partikel är att transportera dess arvsmassa från en infekterad värd cell till en icke-infekterad värd cell och att leverera den till cytoplasman eller kärnan i en replikation-kompetent form1. Denna process utlöses initialt genom bindning till värd cellreceptorer, följt av fusion av spjälkat virus och cellulära membran. För höljeförsedda virus, som influensavirus, Spike glykoproteiner är ansvariga för receptorbindning och fusion1,2. Virala kuvert glykoproteiner (t. ex. pyrogener, antigener), är involverade i många viktiga egenskaper och händelser, såsom virus livscykel initiering (bindning och fusion), viral patogenes, immunogenicitet, värd Cell apoptos och cellulära tropism, den cellulära rutt vägen, liksom mellan arter överföring och omsortiments1,3,4,5,6,7. Forskning om viral kuvert glykoproteiner kommer att hjälpa oss att förstå många aspekter av viral Infection process. Pseudotypifierade viruspartiklar (PP), även kallade pseudovirioner eller pseudopartiklar, kan genereras genom en pseudotypteknik8,9,10. Denna teknik har använts för att utveckla pseudotypifierade partiklar av många virus, inklusive hepatitC 11,12, hepatit B13, vesikulär stomatit virus (VSV) 14,15, och influensavirus16,17,18,19. Denna teknik är baserad på gag-pol protein av lentivirus eller andra retrovirus.
Pseudotypifierade virala partiklar kan erhållas med hjälp av ett tre-plasmid-system genom att cotransfecting en viral kuvert glykoprotein uttryck plasmid, en antiretrovirala förpackning plasmid saknas kuvert ENV genen, och en separat reporter plasmid i PP producent celler. Den retrovirus monteras av dess gag protein, och det knoppar från en infekterad cellmembran som uttrycker viruset kuvert protein1. Därför är det möjligt att få hög titer influensa PPS med retrovirus gag protein för att producera knoppar på ett cellulärt membran som uttrycker influensa HA och NA. I våra tidigare studier, har/NAS i alla kombinationer funktionella och kunna utföra sina motsvarande funktioner i viral livscykel16,17,18,20,21. Dessa PPS används för att undersöka influensaliknande biologiska egenskaper, inklusive hemagglutination, neuraminidastyp aktivitet, ha-receptorbindning tropism, och smittsamhet. Eftersom HA och NA är både viktiga ytfunktionella proteiner i den virala livscykeln, har avvikande och NAs som härrör från olika stammar av influensa delvis kan visa resortimenten mellan dem. Här genererar vi åtta typer av influensa PPS genom att kombinera två har och två NAs (härrör från HPAI H5N1 stam och H7N9 fläcken), med hjälp av ett tre-plasmid pseudotyping system. Dessa åtta typer av PPS inkluderar två infödda PPS, H5N1pp, H7N9pp; två inkompatibla PPS, (H5 + N9) PP, (H7 + N1) PP; och fyra PPS bara hyser en enda glykoprotein (ha eller na), H5pp, N1pp, H7pp, N9pp. studier av influensavirus, såsom H5N1 och H7N9, begränsas av biosäkerhets krav. Alla studier av stammar av vilda influensavirus bör utföras i ett laboratorium för biosäkerhetsnivå 3 (BSL-3). Pseudotypifierad viral partikel teknik kan användas för att paketera en konstgjord spjälkat virus i en inställning för biosäkerhetsnivå 2 (BSL-2). PPS utgör därför ett säkrare och användbart verktyg för att studera influensavirus processer beroende på dess två stora glykoproteiner: hemagglutinin (HA) och neuraminidas (NA).
Detta protokoll beskriver generering av dessa PPS med en tre-plasmid cotransfection strategi (översedd i figur 1), hur man kvantifiera PPS, och smittsamhet upptäckt. PP-produktionen omfattar tre typer av plasmider (figur 1). Den gag-pol genen, som kodar retrovirus gag-pol protein, klonas från en retrovirus förpackning kit och införas i pcdna 3,1 plasmid och heter Pcdna-gag-pol. Den förbättrade gröna fluorescerande protein (eGFP) genen, som kodar grönt fluorescerande protein, klonas från pTRE-EGFP vektor, in i pcDNA 3,1 plasmid, och kallas pcDNA-GFP. Under kloningen tillkom en förpackning signal (ψ) sekvens via en primer. HA och NA gener var klonade i en pVRC plasmid, heter pVRC-HA och pVRC-NA, respektive. Den sista plasmiden kodar fusionsproteinet och kan ersättas med något annat fusionsprotein av intresse. Vår pseudotyping plattform innehåller två glykoproteinuttryck plasmider: pVRC-HA och pVRC-NA. Detta kan förenkla forskningen om omsortiment mellan olika virusstammar i en BSL-2-inställning.
Protocol
Representative Results
Discussion
I detta protokoll beskriver vi en metod för framställning av pseudotypade influensavirus partiklar (PP) i en BSL-2-miljö. Reportern plasmid pcDNA-GFP införlivas i PPS och kan användas för att kvantifiera PPS med FACS i en smittsamhet assay. Vi valde två typer av mottagliga cellinjer eftersom de används ofta i influensaforskning. MDCK celler skulle ge en god kontroll till variabeln förevigade mänskliga celler som används i dessa studier.
Detta protokoll är baserat på retrovirus MLV…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av bidrag från Zhejiang Provincial medicin och hälsovetenskap och teknikplan (Grant Numbers, 2017KY538), Hangzhou kommunal medicin och hälsovetenskap och teknikplan (Grant nummer, OO20190070), Hangzhou Medical Science och Teknik nyckelprojekt (Grant Numbers, 2014Z11) och Hangzhou kommunala autonoma ansöknings projekt för social utveckling och vetenskaplig forskning (Grant Numbers, 20191203B134).
Materials
| Benzonase Nuclease | Millipore | 70664 | Effective viscosity reduction and removal of nucleic acids from protein solutions |
| Clear Flat Bottom Polystyrene TC-treated Microplates (96-well) | Corning | 3599 | Treated for optimal cell attachment Sterilized by gamma radiation and certified nonpyrogenic Individual alphanumeric codes for well identification |
| Clear TC-treated Multiple Well Plates (6-wells) | Costar | 3516 | Individual alphanumerical codes for well identification Treated for optimal cell attachment Sterilized by gamma irradiation |
| Dulbecco's modified essential medium (DMEM) | Gibco | 11965092 | A widely used basal medium for supporting the growth of many different mammalian cells |
| Fetal bovine serum | Excell | FND500 | fetal bovine sera that can offer excellent value for basic cell culture, specialty research, and specific assays |
| Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) | Beckman coulter | cytoflex | |
| Human alveolar adenocarcinoma A549 cells | ATCC | CRM-CCL-185 | |
| Human embryonic kidney (HEK) HEK-293T/17 cells | ATCC | CRL-11268 | A versatile transfection reagent that has been shown to effectively transfect the widest variety of adherent and suspension cell lines |
| Inverted fluorescent biological microscope | Olympus | BX51-32P01-FLB3 | |
| Inverted light microscope | Olympus | CKX31-12PHP | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668019 | Rapid, sensitive and precise probe-based qPCR detection and quantitation of target RNA targets. |
| Luna Universal Probe One-Step RT-qPCR Kit | NEB | E3006L | Will withstand up to 14,000 RCF RNase-/DNase-free Nonpyrogenic |
| Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cells | ATCC | CCL-34 | |
| MaxyClear Snaplock Microcentrifuge Tube (1.5 mL) | Axygen | MCT-150-C | 33 mm, gamma sterilized |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF | Millipore | SLHV033RS | an improved Minimal Essential Medium (MEM) that allows for a reduction of Fetal Bovine Serum supplementation by at least 50% with no change in cell growth rate or morphology. Opti-MEM I medium is also recommended for use with cationic lipid transfection reagents, such as Lipofectamine reagent. |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco | 11058021 | The antibiotics penicillin and streptomycin are used to prevent bacterial contamination of cell cultures due to their effective combined action against gram-positive and gram-negative bacteria. |
| penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | Maximum RCF is 12,500 xg Temperature range from -80 °C to 120 °C RNase-/DNase-free Sterile |
| PP Centrifuge Tubes (15 mL) | Corning | 430791 | a stable and highly reactive serine protease |
| Proteinase K | Beyotime | ST532 | Treated for optimal cell attachment Sterilized by gamma radiation and certified nonpyrogenic |
| TC-treated Culture Dish (60mm) | Corning | 430166 | Trypsin from bovine pancreas TPCK Treated, essentially salt-free, lyophilized powder, ≥10,000 BAEE units/mg protein |
| TPCK-trypsin | Sigma | T1426 | This liquid formulation of trypsin contains EDTA and phenol red. Gibco Trypsin-EDTA is made from trypsin powder, an irradiated mixture of proteases derived from porcine pancreas. Due to its digestive strength, trypsin is widely used for cell dissociation, routine cell culture passaging, and primary tissue dissociation. The trypsin concentration required for dissociation varies with cell type and experimental requirements. |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 |
References
- Knipe, D. M., Howley, P. M. . Fields Virology (6th). , (2013).
- White, J. M., Delos, S. E., Brecher, M., Schornberg, K. Structures and mechanisms of viral membrane fusion proteins: multiple variations on a common theme. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 43 (3), 189-219 (2008).
- Bright, R. A., et al. Cross-clade protective immune responses to influenza viruses with H5N1 HA and NA elicited by an influenza virus-like particle. PLoS One. 3 (1), 1501 (2008).
- Yang, J., et al. Reliability of pseudotyped influenza viral particles in neutralizing antibody detection. PLoS One. 9 (12), 113629 (2014).
- Wyatt, R., Sodroski, J. The HIV-1 envelope glycoproteins: fusogens, antigens, and immunogens. Science. 280 (5371), 1884-1888 (1998).
- Joe, A. K., Foo, H. H., Kleeman, L., Levine, B. The transmembrane domains of Sindbis virus envelope glycoproteins induce cell death. Journal of Virology. 72 (5), 3935-3943 (1998).
- Albecka, A., Laine, R. F., Janssen, A. F., Kaminski, C. F., Crump, C. M. HSV-1 Glycoproteins Are Delivered to Virus Assembly Sites Through Dynamin-Dependent Endocytosis. Traffic. 17 (1), 21-39 (2016).
- Huang, A. S., Palma, E. L., Hewlett, N., Roizman, B. Pseudotype formation between enveloped RNA and DNA viruses. Nature. 252 (5485), 743-745 (1974).
- Rubin, H. Genetic Control of Cellular Susceptibility to Pseudotypes of Rous Sarcoma Virus. Virology. 26, 270-276 (1965).
- Steffen, I., Simmons, G. Pseudotyping Viral Vectors With Emerging Virus Envelope Proteins. Current Gene Therapy. 16 (1), 47-55 (2016).
- Bartosch, B., Dubuisson, J., Cosset, F. L. Infectious hepatitis C virus pseudo-particles containing functional E1-E2 envelope protein complexes. Journal of Experimental Medicine. 197 (5), 633-642 (2003).
- Bian, T., Zhou, Y., Bi, S., Tan, W., Wang, Y. HCV envelope protein function is dependent on the peptides preceding the glycoproteins. Biochemical and Biophysical Research Communications. 378 (1), 118-122 (2009).
- Gudima, S., Meier, A., Dunbrack, R., Taylor, J., Bruss, V. Two potentially important elements of the hepatitis B virus large envelope protein are dispensable for the infectivity of hepatitis delta virus. Journal of Virology. 81 (8), 4343-4347 (2007).
- Yoshida, Y., Emi, N., Hamada, H. VSV-G-pseudotyped retroviral packaging through adenovirus-mediated inducible gene expression. Biochemical and Biophysical Research Communications. 232 (2), 379-382 (1997).
- Burns, J. C., Friedmann, T., Driever, W., Burrascano, M., Yee, J. K. Vesicular stomatitis virus G glycoprotein pseudotyped retroviral vectors: concentration to very high titer and efficient gene transfer into mammalian and nonmammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (17), 8033-8037 (1993).
- Zhang, F., et al. Characterization of pseudoparticles paired with hemagglutinin and neuraminidase from highly pathogenic H5N1 influenza and avian influenza A (H7N9) viruses. Virus Research. 253, 20-27 (2018).
- Zhang, F., et al. Infectivity of Pseudotyped Particles Pairing Hemagglutinin of Highly Pathogenic Avian Influenza a H5N1 Virus with Neuraminidases of The 2009 Pandemic H1N1 and a Seasonal H3N2. Journal of Bioterrorism & Biodefense. 2, 104 (2011).
- Wu, J., et al. Characterization of neuraminidases from the highly pathogenic avian H5N1 and 2009 pandemic H1N1 influenza A viruses. PLoS One. 5 (12), 15825 (2010).
- Nefkens, I., et al. Hemagglutinin pseudotyped lentiviral particles: characterization of a new method for avian H5N1 influenza sero-diagnosis. Journal of Clinical Virology. 39 (1), 27-33 (2007).
- Zhang, Y., et al. Hemagglutinin and neuraminidase matching patterns of two influenza A virus strains related to the 1918 and 2009 global pandemics. Biochemical and Biophysical Research Communications. 387 (2), 405-408 (2009).
- Lin, X., et al. Oseltamivir boosts 2009 H1N1 virus infectivity in vitro. Biochemical and Biophysical Research Communications. 390 (4), 1305-1308 (2009).
- McKay, T., Patel, M., Pickles, R. J., Johnson, L. G., Olsen, J. C. Influenza M2 envelope protein augments avian influenza hemagglutinin pseudotyping of lentiviral vectors. Gene Therapy. 13 (8), 715-724 (2006).
- Pan, H., et al. Autophagy mediates avian influenza H5N1 pseudotyped particle-induced lung inflammation through NF-kappaB and p38 MAPK signaling pathways. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (2), 183-195 (2014).
- Szecsi, J., et al. Induction of neutralising antibodies by virus-like particles harbouring surface proteins from highly pathogenic H5N1 and H7N1 influenza viruses. Virology Journal. 3, 70 (2006).
- Garcia, J. M., Lagarde, N., Ma, E. S., de Jong, M. D., Peiris, J. S. Optimization and evaluation of an influenza A (H5) pseudotyped lentiviral particle-based serological assay. Journal of Clinical Virology. 47 (1), 29-33 (2010).
- Garcia, J. M., Lai, J. C. Production of influenza pseudotyped lentiviral particles and their use in influenza research and diagnosis: an update. Expert Review of Anti-infective Therapy. 9 (4), 443-455 (2011).
- Haynes, J. R., et al. Influenza-pseudotyped Gag virus-like particle vaccines provide broad protection against highly pathogenic avian influenza challenge. Vaccine. 27 (4), 530-541 (2009).
- Schmeisser, F., et al. Production and characterization of mammalian virus-like particles from modified vaccinia virus Ankara vectors expressing influenza H5N1 hemagglutinin and neuraminidase. Vaccine. 30 (23), 3413-3422 (2012).
- Liu, Y. V., et al. Chimeric severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV) S glycoprotein and influenza matrix 1 efficiently form virus-like particles (VLPs) that protect mice against challenge with SARS-CoV. Vaccine. 29 (38), 6606-6613 (2011).
- Moeschler, S., Locher, S., Conzelmann, K. K., Kramer, B., Zimmer, G. Quantification of Lyssavirus-Neutralizing Antibodies Using Vesicular Stomatitis Virus Pseudotype Particles. Viruses. 8 (9), 254 (2016).
- Lai, A. L., Millet, J. K., Daniel, S., Freed, J. H., Whittaker, G. R. The SARS-CoV Fusion Peptide Forms an Extended Bipartite Fusion Platform that Perturbs Membrane Order in a Calcium-Dependent Manner. Journal of Molecular Biology. 429 (24), 3875-3892 (2017).
- Millet, J. K., et al. Middle East respiratory syndrome coronavirus infection is inhibited by griffithsin. Antiviral Research. 133, 1-8 (2016).
- Millet, J. K., et al. Production of Pseudotyped Particles to Study Highly Pathogenic Coronaviruses in a Biosafety Level 2 Setting. Journal of Visualized Experiments. (145), e59010 (2019).
- Ma, M., et al. Murine leukemia virus pseudotypes of La Crosse and Hantaan Bunyaviruses: a system for analysis of cell tropism. Virus Research. 64 (1), 23-32 (1999).
- Wool-Lewis, R. J., Bates, P. Characterization of Ebola virus entry by using pseudotyped viruses: identification of receptor-deficient cell lines. Journal of Virology. 72 (4), 3155-3160 (1998).
- Chen, C. M., et al. Production and design of more effective avian replication-incompetent retroviral vectors. 발생학. 214 (2), 370-384 (1999).
- Kaku, Y., et al. Second generation of pseudotype-based serum neutralization assay for Nipah virus antibodies: sensitive and high-throughput analysis utilizing secreted alkaline phosphatase. Journal of Virological Methods. 179 (1), 226-232 (2012).
- Rudiger, D., Kupke, S. Y., Laske, T., Zmora, P., Reichl, U. Multiscale modeling of influenza A virus replication in cell cultures predicts infection dynamics for highly different infection conditions. PLOS Computational Biology. 15 (2), 1006819 (2019).
- Petiot, E., et al. Influenza viruses production: Evaluation of a novel avian cell line DuckCelt(R)-T17. Vaccine. 36 (22), 3101-3111 (2018).
