Summary

Приготовление SNS Cobalt (II) Пинцер Модель комплексов печени Алкоголь Дегидрогеназы

Published: March 19, 2020
doi:

Summary

Здесь представлена подготовка модельных комплексов SNS-клещевого кобальта (II) дегидрогеназы печени. Комплексы могут быть подготовлены путем реагирования на лигандовый предшественник с CoCl2No6H2O, а затем могут быть recrystallized, позволяя диэтил эфир медленно диффузного раствора, который содержит комплекс кобальта.

Abstract

Химические модельные комплексы подготовлены для представления активного участка фермента. В этом протоколе, семейство трезубца клещевых лиганских прекурсоров (каждый из которых обладает двумя серными и одними атомными функциональными возможностями атома азотного донора (SNS) и на основе бис-имидазола или бис-триазола соединений) металлоконструкции с CoCl26H2O, чтобы позволить себе трезубца SNS pincer кобальта кобальта (II) комплексов. Приготовление кобальтовых (II) модельных комплексов для дегидрогеназы печени является легкой. На основе быстрого изменения цвета при добавлении CoCl2No 6H2O в ацетонитрил решение, которое содержит лиганд овый предшественник, комплекс формируется быстро. Формирование металлического комплекса завершено после того, как раствор может рефлюкс ночь. Эти кобальтовые (II) комплексы служат образцом для активного участка цинка в дегидрогеназе печени (LADH). Комплексы характеризуются с использованием однокристаллической рентгеновской дифракции, масс-спектрометрии электроспрей, ультрафиолетовой видимой спектроскопии и элементарного анализа. Для точного определения структуры комплекса необходимо определить его единую кристаллическую структуру. Одиночные кристаллы комплексов, пригодных для рентгеновской дифракции, затем выращиваются с помощью медленного распространения диэтилового эфира в раствор ацетонитрила, который содержит комплекс кобальта (II). Для кристаллов высокого качества, recrystallization типично осуществляет над периодом 1 недели, или более длиной. Метод может быть применен к подготовке других модельных координационных комплексов и может быть использован в учебных лабораториях. Наконец, считается, что другие могут найти этот метод рекристаллизации для получения отдельных кристаллов полезным для их исследований.

Introduction

Целью представленного метода является подготовка маломолекулярных аналогов LADH для дальнейшего понимания каталитической активности металлоэнзимов. LADH является димерическим ферментом, который содержит кофакторно-связывающий домен и цинк (II) металлосодержащий каталитический домен1. LADH, в присутствии кофактора NADH, может уменьшить кетоны и альдегиды до их соответствующих производных алкоголя2. В присутствииNAD, LADH может выполнять обратный катализ окисления спиртов кетонов и альдегидов2. Кристаллическая структура активного участка LADH показывает, что его цинк (II) металлический центр связан с одним атомом азота, предоставляемым гистидиновой боковой цепью и двумя атомами серы и предлагаемых двумя цистеиновыми лигандами3. Дальнейшие исследования показали, что центр цинка металла ligated с молекулой воды лабильно, в результате чего псевдо-тетраэдральной геометрии вокруг металлического центра4.

Мы ранее сообщали и использовали Прекурсоры SNS pincer ligand, а также металлоконструкции лигандовых прекурсоров с комплексами NCl2, чтобы сформировать комплексы ,n(II), которые содержат прекурсор трезубца ligand5,,6,7. Эти лиганды предшественники показаны на рисунке 1. Эти цинковые комплексы продемонстрировали активность для стойхиометрического сокращения электроно-бедных альдегидов и, таким образом, являются модельными комплексами для LADH. Впоследствии, синтез и характеристика серии медных (I) и медных (II) комплексов, которые содержат Прекурсоры SNS ligand были зарегистрированы8,,9,10.

Хотя LADH является ферментом цинка (II), мы заинтересованы в подготовке кобальтовых (II) модельных комплексов LADH для получения дополнительной спектроскопической информации об аналогах кобальта (II) LADH. Комплексы кобальта (II) окрашены, в то время как цинковые (II) комплексы небелые. Поскольку комплексы кобальта (II) являются цветными, можно получить ультрафиолетовые видимые спектры комплексов, в которых также можно собирать информацию о прочности лигандного поля в комплексах кобальта (II). Используя информацию из гауссских расчетов и экспериментально полученные ультрафиолетовые видимые спектры, можно вывести информацию о прочности лигандного поля. Cobalt (II) является хорошей заменой цинка (II), так как оба иона имеют аналогичные ионные радиусы и аналогичные кислотыЛьюис1,12.

Представленный метод включает в себя синтез и характеристику модельных комплексов, чтобы попытаться имитировать естественное каталилитическое поведение LADH5,6. Ранее мы металлизировали семейство лигандовых прекурсоров2 с модельными комплексами цинка (II) LADH, которые смоделировали структуру и реактивность активного участка цинка в LADH4. Благодаря многочисленным экспериментам, эти лиганды клещей оказались надежными в различных условиях окружающей среды и остались стабильными с разнообразной коллекцией прикрепленных R-групп. 5,6

Tridentate лиганды предпочтительнее по сравнению с монодентатными лигандами, потому что они оказались более успешными с металлированием из-за сильных эффектов хелата трезубца. Это наблюдение связано с более благоприятствования энтропии tridentate клещевых лиганд формирования по сравнению с монодентатом лиганд13. Кроме того, tridentate клещи лиганды, вероятно, для предотвращения димеризации металлических комплексов, что является благоприятствования, поскольку димеризация, вероятно, замедлит каталитической активности комплекса14. Таким образом, использование трезубца клещевых лигандов оказалось успешным в органометрической химии при подготовке каталитических активных и надежных комплексов. Комплексы SNS клещи были менее изучены, чем другие системы клещевого, так как комплексы клещевого содержания обычно содержат второе и третьеряду переходные металлы15.

Это исследование металлоэнзиминов может помочь дальнейшему пониманию их ферментатической активности, которая может быть применена к другим областям биологии. Этот метод синтеза модельных комплексов по сравнению с альтернативным методом (синтез всего белка LADH) является благоприятным по ряду причин. Первое преимущество заключается в том, что типовые комплексы имеют низкую молекулярную массу и по-прежнему способны точно представлять каталитической активности и условия окружающей среды активного участка природного фермента. Во-вторых, типовые комплексы проще работать с надежными и релятивируемыми данными.

Данная рукопись описывает синтетическую подготовку и характеристику двух комплексов моделей клещевого клещевого кобляка LADH. Оба комплекса оснащены лиганом, который содержит атомы серы, азота и серы донора. Первый комплекс(4)основан на предшественнике имидазола, а второй (5) основан на предшественнике триазола. Комплексы показывают реактивность для снижения стоихиометрии электронов бедных альдегидов в присутствии водородного донора. Эти результаты реактивности будут сообщены в последующей рукописи.

Protocol

1. Синтез хлоро-(n3-S,S,N)–2,6-бис(N-изопропил-N’-метиленимидазол-2-тион)пиридин-кобальт (II)тетрахлорокобалтате Для подготовки комплекса 4,добавить 0,121 г (3,12 х 10-4 моль) из 2,6-бис (N-изопропил-N’-метиленимидазол-2-тион)пиридин (C19H25N5S2)6 до 15 ?…

Representative Results

СинтезСинтезы комплексов 4 и 5 были успешно проведены путем реагирования на раствор ацетонитрила, содержащий предшественник бис-тионлига с хобальным гексагидратом хлорида(рисунок 2). Эта реакция произошла при рефлюксной температуре в прис?…

Discussion

Подготовка комплексов 4 и 5 является легкой. Ключевым шагом является добавление твердого CoCl2No6H2O в ацетонитрил решение, которое содержит соответствующий лигный предшественник. Раствор становится темно-зеленым в течение нескольких секунд после добавления C…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Джон Мичниковски получил финансовую поддержку от следующего для этого проекта: Коннектикут НАСА космических грантов альянса (награда номер P-1168), Фэрфилд университет Научный институт, Колледж искусств и наук Издательский фонд, Фэрфилд Летний научно-исследовательский стипендий факультета университета, и Национальный научный фонд-основные исследовательские инструменты программы (Грант номер CHE-1827854) для средств для приобретения 400 МГц NMR спектрометр. Он также благодарит Теренса Ву (Yale University) за помощь в приобретении электроспрей масс-спектра. Джерри Jasinski признает Национальный научный фонд-основные исследовательские инструменты программы (Грант номер CHE-1039027) для средств на покупку рентгеновского диффрактометра. Шейла Бонитатибус, Эмильсе Альманза, Рами Харбуш и Саманта Зигмонт признают, что программа ученых Хардимана предоставляет свои летние стипендии на исследования.

Materials

100 mL Round Bottomed Flask Chem Glass CG150691 100mL Single Neck Round Bottomed Flask, 19/22 Outer Joint
Acetonitrile Fisher HB9823-4 HPLC Grade
Chiller for roto-vap Lauda L000638 Alpha RA 8
Cobalt Chloride hexahydrate Acros Organics AC423571000 Acros Organics
Diethyl Ether Fisher E-138-1 Diethyl Ether Anhydorus
graduated cylinder Fisher S63456 25 mL graduated cylinder
hotplate Fisher 11-100-49SH Isotemp Basic Stirring Hotplate
jars Fisher 05-719-481 250 mL jars
Ligand —– —– Synthezied previously by Professor Miecznikowski
medium cotton balls Fisher 22-456-80 medium cotton balls
one dram vials Fisher 03-339 one dram vials with TFE Lined Cap
pipet Fisher 13-678-20B 5.75 inch pipets
pipet bulbs Fisher 03-448-21 Fisher Brand Latex Bulb for pipet
recrystallizing dish for sand bath Fisher 08-741 D 325 mL recrystallizing dish for sand bath
reflux condensor Chem Glass CG-1218-A-22 Condenser with 19/22 inner joint
Rotovap Heidolph Collegiate 36000090 Brinkmann; Heidolph Collegiate Rotary Evaporator with Heidolph WB eco bath Heidolph Rotary Evaporator
sea sand for sandbath Acros Organics 612355000 washed sea sand for sand bath
Stir bar Fisher 07-910-23 Egg-Shaped Magnetic Stir Bar
Vacum grease Fisher 14-635-5D Dow Corning High Vacuum Grease
vacuum pump for rotovap Heidolph Collegiate 36302830 Heidolph Rotovac Valve Control

References

  1. Holm, R. H., Kennepohl, P., Solomon, E. I. Structural and Functional Aspects of Metal Sites in Biology. Chemical Reviews. 96 (7), 2239-2314 (1996).
  2. Ibers, J. A., Holm, R. H. Modeling coordination sites in metallobiomolecules. Science. 209 (4453), 223-235 (1980).
  3. Kannan, K. K., et al. Crystal structure of human erythrocyte carbonic anhydrase B. Three-dimensional structure at a nominal 2.2-A resolution. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 72 (1), 51-55 (1975).
  4. Eklund, H., Brändén, C. I. Structural differences between apo- and holoenzyme of horse liver alcohol dehydrogenase. Journal of Biological Chemistry. 254, 3458-3461 (1979).
  5. Miecznikowski, J. R., et al. Syntheses, Characterization, Density Functional Theory Calculations and Activity of Tridentate SNS Zinc Pincer Complexes. Inorganica Chimica Acta. 376, 515-524 (2011).
  6. Miecznikowski, J. R., et al. Syntheses, Characterization, Density Functional Theory Calculations, and Activity of Tridentate SNS Zinc Pincer Complexes Based on Bis-Imidazole or Bis-Triazole Precursors. Inorganica Chimica Acta. 387, 25-36 (2012).
  7. Sunderland, J. R., et al. Investigation of liver alcohol dehydrogenase catalysis using an NADH biomimetic and comparison with a synthetic zinc model complex. Polyhedron. 114, 145-151 (2016).
  8. Miecznikowski, J. R., et al. Synthesis and characterization of three- and five-coordinate copper(II) complexes based SNS ligand precursors. Polyhedron. 80, 157-165 (2014).
  9. Miecznikowski, J. R., et al. Synthesis, Characterization, and Computational Study of Three-Coordinate SNS Copper(I) Complexes based on Bis-Thione Ligand Precursors. Journal of Coordination Chemistry. 67, 29-44 (2014).
  10. Lynn, M. A., et al. Copper(I) SNS Pincer Complexes: Impact of Ligand Design and Solvent Coordination on Conformer Interconversion from Spectroscopic and Computational Studies. Inorganica Chimica Acta. 495, (2019).
  11. . Web Elements Available from: https://www.webelements.com/zinc/atom_sizes.html (2019)
  12. . Web Elements Available from: https://www.webelements.com/cobalt/atom_sizes.html (2019)
  13. Caballero, A., Díez-Barra, E., Jalón, F. A., Merino, S., Tejeda, J. 1,1′-(pyridine-2,6-diyl)bis(3-benzyl-2,3-dihydro-1H-imidazol-2-ylidine), a new multidentate N-heterocyclic bis-carbene and its silver(I) complex derivative. Journal of Organometallic Chemistry. 617-618, 395-398 (2001).
  14. Albrecht, M., van Koten, G. Platinum Group Organometallics Based on “Pincer” Complexes: Sensors, Switches, and Catalysis. Angewandte Chemie International Edition. 40 (20), 3750-3781 (2001).
  15. Peris, E., Crabtree, R. H. Key factors in pincer ligand design. Chemistry Society Reviews. 47, 1959-1968 (2018).
  16. Dolomanov, O. V., Bourhis, L. J., Gildea, R. J., Howard, J. A. K., Puschmann, H. A complete structure, solution, refinement, and analysis program. Journal of Applied Crystallography. 42, 339-341 (2009).
  17. Sheldrick, G. M. Integrated Space Group and Crystal Structure Determination. Acta Crystallography. 71, 3-8 (2015).
  18. Sheldrick, G. M. Crystal Structure Refinement with SHELXL. Acta Crystallography. 71, 3-8 (2015).
  19. Pauling, L. Metal-metal bond lengths in complexes of transition metals. Proceedings of the National Academies of the Sciences of the United States of America. 73, 4290-4293 (1976).
  20. Trzhtsinskaya, B. V., Abramova, N. D. Imidazole-2-Thiones: Synthesis, Structure, Properties. Sulfur Reports. 10 (4), 389 (1991).
  21. Schneider, G., Eklund, H., Cedergren-Zeppezauer, E., Zeppezauer, M. Crystal structure of the active site in specifically metal-depleted and cobalt substituted horse liver alcohol dehydrogenase derivatives. Proceedings of the National Academies of the Sciences of the United States of America. 80, 5289-5293 (1983).
  22. Yang, L., Powell, D. R., Houser, R. P. Structural variation in copper(I) complexes with pyridylmethylamide ligands: structural analysis with a new four-coordinate geometry index, τ4. Dalton Transactions. , 955-964 (2007).

Play Video

Cite This Article
Miecznikowski, J. R., Jasinski, J. P., Kaur, M., Bonitatibus, S. C., Almanza, E. M., Kharbouch, R. M., Zygmont, S. E., Landy, K. R. Preparation of SNS Cobalt(II) Pincer Model Complexes of Liver Alcohol Dehydrogenase. J. Vis. Exp. (157), e60668, doi:10.3791/60668 (2020).

View Video