Bereiding van Meiotic Chromosome Spreads van Zebrafish Spermatocyten
Summary
Nucleaire oppervlaktespreads zijn een onmisbaar hulpmiddel voor het bestuderen van chromosoomgebeurtenissen tijdens meiose. Hier demonstreren we een methode om meiotische chromosomen voor te bereiden en te visualiseren tijdens profase I van zebravissen spermatocyten.
Abstract
Meiose is het belangrijkste cellulaire proces dat nodig is om haploïde gameten te maken voor seksuele voortplanting. Modelorganismen hebben een belangrijke rol gespeeld bij het begrijpen van de chromosoomgebeurtenissen die plaatsvinden tijdens de meiotische profase, waaronder de koppeling, synapsis en recombinatiegebeurtenissen die zorgen voor een goede chromosoomsegregatie. Hoewel de muis een belangrijk model is geweest voor het begrijpen van de moleculaire mechanismen die aan deze processen ten grondslag liggen, zijn niet alle meiotische gebeurtenissen in dit systeem analoog aan menselijke meiose. We hebben onlangs het opwindende potentieel van de zebravissen aangetoond als een model van menselijke spermatogenese. Hier beschrijven we, in detail, onze methoden om meiotische chromosomen en bijbehorende eiwitten te visualiseren in chromosoomspreadpreparaten. Deze preparaten hebben het voordeel dat de analyse van chromosoomstructuren met hoge resolutie kan worden geanalyseerd. Ten eerste beschrijven we de procedure voor het ontleden van teelballen van volwassen zebravis, gevolgd door celdissociatie, lyse en verspreiding van de chromosomen. Vervolgens beschrijven we de procedure voor het detecteren van de lokalisatie van meiotische chromosoomeiwitten, door immunofluorescentiedetectie en nucleïnezuursequenties, door fluorescentie in situ hybridisatie (FISH). Deze technieken omvatten een nuttige set van instrumenten voor de cytologische analyse van meiotic chromatine architectuur in het zebravissysteem. Onderzoekers in de zebravisgemeenschap moeten deze technieken snel onder de knie kunnen krijgen en opnemen in hun standaardanalyses van de voortplantingsfunctie.
Introduction
Seksuele voortplanting verloopt door de combinatie van twee haploïde gameten, die elk de helft van de chromosoomcomplement van een somatische cel dragen. Meiosis is een gespecialiseerde celdeling die haploïde gameten produceert door middel van een ronde van DNA-replicatie en twee opeenvolgende rondes van chromosoom segregatie. In profase I moeten homologe chromosomen (homologs) koppeling, recombinatie en synapsis ondergaan, waarvan de laatste wordt gekenmerkt door de vorming van het synaptonemale complex dat bestaat uit twee homologassen die overbrugd zijn door de transversale gloeidraad, Sycp1 (figuur 1A, B). Het niet goed uitvoeren van deze processen kan leiden tot de productie van aneuploïde gameten, die een belangrijke oorzaak zijn van miskramen bij mensen1. Onze kennis van de coördinatie tussen koppeling, recombinatie en synapsis is gefaciliteerd door studies in een breed scala van organismen, zoals gist, C. elegans,muis, en Drosophila, onder andere2. Terwijl het algemene proces van homologe chromosoomkoppeling, gevolgd door segregatie, goed wordt bewaard, varieert de afhankelijkheid van recombinatie en synapsis en de volgorde van deze gebeurtenissen.
Meiotic double-strand break (DSB) formatie, die homologe recombinatie initieert, treedt op in de buurt van telomeren geclusterd in het boeket tijdens leptotene en synapsis ontstaat kort na3,4. Deze configuratie van DSB-vorming en synapsisinitiatie is ook een kenmerk van mannelijke meiose bij demens,maar niet bij muis5,6,7,8, wat suggereert dat zebravissen als model voor menselijke spermatogenese kunnen dienen. Er zijn ook verschillende praktische voordelen van het bestuderen van zebravissen meiose. Zowel mannetjes als vrouwtjes ondergaan gametogenese gedurende de volwassenheid, hun geslachtsklieren zijn gemakkelijk toegankelijk, en honderden nakomelingen worden gegenereerd uit een enkel kruis. Bovendien zijn de embryo’s transparant en ontwikkelen ze zich extern, wat de vroegtijdige opsporing van afwijkingen in de embryonale ontwikkeling als gevolg van aneuploïde gameten3,9vergemakkelijkt. Nadelen van het gebruik van zebravis zijn dat ze traag zijn om seksuele rijpheid te bereiken (~ 60 dagen) en de hoeveelheid materiaal die nodig is voor nucleaire oppervlakte spreads moet worden verzameld van ~ 10-20 volwassen dieren, afhankelijk van hun grootte.
Meiotic chromosoom spread preparaten zijn een essentieel hulpmiddel voor het bestuderen van chromosoom dynamiek in alle modelorganismen, omdat de belangrijkste handtekeningen van meiotische chromosoom dynamiek kunnen worden onderzocht. Bij zebravis zijn belangrijke aspecten van de progressie van het meiotische programma en de nucleaire organisatie ontleed door indringende nucleaire oppervlaktespreads, hier aangeduid als chromosoomspreads, met antilichamen voor immunofluorescentiedetectie van eiwitten en/of nucleïnezuren door FISH3,4,9,10,11,12. Inderdaad, de gepolariseerde lokalisatie van geclusterde telomeren in het boeket kan worden bewaard in de spread preparaat (Figuur 1C). Onlangs hebben we zebravissen spermatocyten chromosoom spreads samen met fluorescentie detectie methoden en super-resolutie microscopie gebruikt om de gedetailleerde progressie van zebravissen telomeer dynamiek, homologe chromosoom koppeling, dubbele-streng breuk lokalisatie, en synapsis op key meiotic overgangen3verduidelijken. Hier presenteren we methoden om chromosoomspreads van spermatocyten van de zebravisteös voor te bereiden en ze vervolgens te bevlekken met fluorescerend peptide nucleïnezuur (PNA) sondes tot herhaalde telomeersequenties en immunofluorescentiedetectie van chromosoomgeassocieerde eiwitten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschrijven we methoden om de locatie van telomeren en chromosoom-geassocieerde eiwitten in nucleaire oppervlakte spreads van spermatocyten geïsoleerd van zebravis tetesten sonde. We verwachten dat deze methoden van toepassing zullen zijn voor de analyse van spermatocyten in andere teleostsoorten met aanpassing aan de grootte van de testis.
Hoewel slechts een paar antilichamen zijn verhoogd tot zebravis meiotic eiwitten, hebben we succes gehad met behulp van de volgende antilichamen verh…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Trent Newman en Masuda Sharifi voor opmerkingen over het manuscript en An Nguyen voor het helpen optimaliseren van methoden voor het verspreiden en bevlekken van chromosomen van zebravissen meiocyten. Dit werk werd ondersteund door NIH R01 GM079115 toegekend aan S.M.B.
Materials
| 1.5 mL centrifuge tubes | Several commercial brands available | ||
| 1.5 mL microcentrifuge tube rack | Several commercial brands available | ||
| 16% formaldehyde, methanol-free | ThermoFisher Scientific | 28908 | |
| 2 mL | Several commercial brands available | ||
| 24 x 50 mm glass coverslips | Corning | 2980-245 | |
| 24 x 60 mm glasscoverslips | VWR International | 16004-312 | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | ThermoFisher Scientific | 363696 | |
| Autoclave bag | Several commercial brands available | Used to make plastic coverslips. | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1605-100 | Prepare a 100 mg/ml stock solution in sterile distilled water. |
| Cell Strainer, 100 µm | Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| CF405M goat anti-chicken IgY (H+L), highly cross-adsorbed | Biotium | 203775-500uL | Use at 1:1000 |
| Chicken anti-zfSycp1 | Generated by Burgess lab | N/A | Use at 1:100 |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C0130-500MG | |
| Coplin jar | Several commercial brands available | ||
| DNase I, grade II from bovine pancreas | Roche Diagnostics | 10104159001 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Fisher Scientific | MT10014CV | |
| Dumont No. 5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | Two are required for dissecting the testes. |
| Eppendorf Tubes, 5 mL | VWR International | 89429-308 | |
| Formamide | Fisher Scientific | BP228-100 | |
| Goat anti-chicken IgY (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11039 | Use at 1:1000 |
| Goat anti-chicken IgY (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A-11042 | Use at 1:1000 |
| Goat anti-hDMC1 | Santa Cruz Biotechnology | sc-8973 | Does not work in our hands |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11008 | Use at 1:1000 |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A-11012 | Use at 1:1000 |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023-10mL | |
| Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | H3393-100KU | |
| Humidity chamber | Fisher Scientific | 50-112-3683 | |
| Hybridization Oven | VWR International | 230401V (Model 5420) | |
| Incubator Shaker | New Brunswick Scientific | Model Classic C25 | |
| KCl | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Kimwipes | Kimerbly-Clark Professional | 34155 | Used for the humidity chamber |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Microscope | Several commercial brands available | Any standard microscope capable of at least ~1.65X magnification is sufficient. | |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Mouse anti-hamsterSCP3 | Abcam | ab97672 | Does not work in our hands |
| Mouse anti-hMLH1 | BD Biosciences | 550838 | Does not work in our hands |
| Mouse anti-hRPA | Sigma-Alrich | MABE285 | Does not work in our hands |
| Na2HPO4 · 7 H2O | Fisher Scientific | S373-500 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-3 | |
| Photo-Flo 200 solution | Electron Microscopy Sciences | 74257 | |
| Plastic transfer pipettes | Several commercial brands available | ||
| PNA TelC-Alexa647 | PNA Bio Inc | F1013 | Prepare as per manufacturer's instructions. |
| PNA TelC-Cy3 | PNA Bio Inc | F1002 | Prepare as per manufacturer's instructions. |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | ThermoFisher Scientific | P36970 | |
| ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI | ThermoFisher Scientific | P36971 | |
| Rabbit anti-hRPA | Bethyl | A300-244A | Use at 1:300 |
| Rabbit anti-hSCP3 | Abcam | ab150292 | Use at 1:200 |
| Rabbit anti-hRad51 | GeneTex | GTX100469 | Use at 1:300 |
| Sodium citrate | Fisher Scientific | S279-500 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Supercut Scissors, 30° angle, 10 cm | Fisher Scientific | 50-822-353 | Can also use any pair of small scissors. |
| Sylgard kit | Fisher Scientific | NC9897184 | Prepare as per manufacturer's instructions. |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | Dilute in sterile distilled water to make a 20% working solution. Store at room temperature. Triton X-100 forms a precipitate when diluted in water; precipitate dissolves overnight. |
| Trypsin | Worthington Biochemical | LS003708 | |
| Trypsin inhibitor from chicken egg white | Sigma-Aldrich | T9253-500MG | |
| Tween 20 | Bio-Rad | 170-6531 | Dilute in sterile distilled water to make a 20% working solution. Store at room temperature. |
| Vannas Spring Scissors – 4 mm (micro scissors) | Fine Science Tools | 15018-10 |
References
- Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem. Nature Reviews Genetics. 13, 493-504 (2012).
- Zickler, D., Kleckner, N. Recombination, Pairing, and Synapsis of Homologs during Meiosis. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, (2015).
- Blokhina, Y. P., Nguyen, A. D., Draper, B. W., Burgess, S. M. The telomere bouquet is a hub where meiotic double-strand breaks, synapsis, and stable homolog juxtaposition are coordinated in the zebrafish, Danio rerio. PLoS Genetics. 15, e1007730 (2019).
- Saito, K., Sakai, C., Kawasaki, T., Sakai, N. Telomere distribution pattern and synapsis initiation during spermatogenesis in zebrafish. Developmental Dynamics. 243, 1448-1456 (2014).
- Oliver-Bonet, M., Turek, P. J., Sun, F., Ko, E., Martin, R. H. Temporal progression of recombination in human males. Molecular Human Reproduction. 11, 517-522 (2005).
- Gruhn, J. R., Rubio, C., Broman, K. W., Hunt, P. A., Hassold, T. Cytological studies of human meiosis: sex-specific differences in recombination originate at, or prior to, establishment of double-strand breaks. PLoS One. 8, e85075 (2013).
- Pratto, F., et al. Recombination initiation maps of individual human genomes. Science. 346, 1256442 (2014).
- Brown, P. W., et al. Meiotic synapsis proceeds from a limited number of subtelomeric sites in the human male. American Journal of Human Genetics. 77, 556-566 (2005).
- Poss, K. D., Nechiporuk, A., Stringer, K. F., Lee, C., Keating, M. T. Germ cell aneuploidy in zebrafish with mutations in the mitotic checkpoint gene mps1. Genes and Development. 18, 1527-1532 (2004).
- Saito, K., Siegfried, K. R., Nüsslein-Volhard, C., Sakai, N. Isolation and cytogenetic characterization of zebrafish meiotic prophase I mutants. Developmental Dynamics. 240, 1779-1792 (2011).
- Sansam, C. L., Pezza, R. J. Connecting by breaking and repairing: mechanisms of DNA strand exchange in meiotic recombination. Febs Journal. 282, 2444-2457 (2015).
- Feitsma, H., Leal, M. C., Moens, P. B., Cuppen, E., Schulz, R. W. Mlh1 Deficiency in Zebrafish Results in Male Sterility and Aneuploid as Well as Triploid Progeny in Females. 유전학. 175, 1561-1569 (2007).
- Dia, F., Strange, T., Liang, J., Hamilton, J., Berkowitz, K. M. Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Mouse Spermatocytes. Journal of Visualized Experiments. (129), e55378 (2017).
- Moens, P. B. Zebrafish: chiasmata and interference. Genome. 49, 205-208 (2006).
- Lisachov, A. P., Zadesenets, K. S., Rubtsov, N. B., Borodin, P. M. Sex chromosome synapsis and recombination in male guppies. Zebrafish. 12 (2), 174-180 (2015).
- Ocalewicz, K., Mota-Velasco, J. C., Campos-Ramos, R., Penman, D. J. FISH and DAPI staining of the synaptonemal complex of the Nile tilapia (Oreochromis niloticus) allow orientation of the unpaired region of bivalent 1 observed during early pachytene. Chromosome Research. 17 (6), 773 (2009).
