ゼブラフィッシュの精子細胞からのマイオサイト染色体の広がりの調製
Summary
核表面の拡散は、間見下がれの間に染色体の事象を研究するために不可欠なツールです。ゼブラフィッシュの精子から前相Iの間にマイオサイト染色体を調製し、可視化する方法を実証する。
Abstract
Meiosisは、性的生殖のためのハプロイドの解球を作成するために必要な重要な細胞プロセスです。モデル生物は、ペアリング、シナプス、適切な染色体分離を保証する組み換えイベントなど、マイオティックの前相中に起こる染色体事象を理解するのに役立っています。マウスは、これらのプロセスの根底にある分子メカニズムを理解するための重要なモデルであったが、このシステム内のすべてのマイオティック事象は人間のマイオーシスに類似しているわけではない。我々は最近、ヒト精子形成のモデルとしてゼブラフィッシュのエキサイティングな可能性を実証した。ここでは、染色体広がり製剤におけるマイオサイト染色体および関連タンパク質を可視化する方法について詳しく説明します。これらの製剤は、染色体構造の高解像度分析を可能にするという利点を有する。まず、成体ゼブラフィッシュから精巣を解剖し、続いて細胞解離、分解、染色体の広がりについて説明する。次に、蛍光インシトゥハイブリダイゼーション(FISH)による生声染色体タンパク質の局在を検出する方法について、免疫蛍光検出、および核酸配列を挙げる。これらの技術はゼブラフィッシュ系におけるマイオティッククロマチンアーキテクチャの細胞学的分析に有用なツールセットを含む。ゼブラフィッシュコミュニティの研究者は、これらの技術を迅速に習得し、生殖機能の標準的な分析に組み込むことができるはずです。
Introduction
性的生殖は、2つのハプロイド・アプタの組み合わせを通して進行し、それぞれが体細胞の染色体補体の半分を運ぶ。Meiosisは、DNA複製の1ラウンドと染色体分離の2つの連続したラウンドを通じてハプロイドのアホテを生成する特殊な細胞分裂である。前相Iでは、相同染色体(ホモログ)は、対合、組換え、およびシナプス化を受けなければならないが、後者は、横断フィラメントによって架橋された2つの相同軸を含むシナプトン複合体の形成によって特徴付けられる、Sycp1(図1A、B)。これらのプロセスを適切に実行しないと、人間の流産の主な原因である異常の多い球体の生産につながる可能性があります1.組み合わせ、組換え、シナプスの間の協調に関する我々の知識は、酵母、C.エレガンス、マウス、ショウジョウバエなどの幅広い生物の研究によって促進されてきた2。相同染色体の組み合わせの一般的なプロセスは、分離が続くが十分に保存されているが、組換えとシナプス化への依存性とこれらのイベントの順序は異なります。
相同の組換えを開始するマイオティック二重鎖破断(DSB)形成は、レプトテンおよびシナプスの間に花束に集まったテロメアの近くで発生し、シナプスは3、4の直後に続く。DSB形成およびシナプス開始のこの構成はまた、ヒトにおける男性のマイオシスの特徴であるが、マウス5、6、7、8では、 ゼブラフィッシュがヒト精子形成のモデルとして役立つことを示唆している。ゼブラフィッシュのマイオーザ症を研究するいくつかの実用的な利点もあります。男性と女性の両方が成人期を通じてゲーム形成を受け、生殖腺は簡単にアクセスでき、何百もの子孫が単一の十字架から生成されます。さらに、胚は透明であり、外部的に発達し、これは、異常体素3、9による胚発生における収差の早期発見を容易にする。ゼブラフィッシュを使用することの欠点は、性的成熟度(約60日)に達するのが遅く、核表面に必要な物質の量は、その大きさに応じて〜10〜20匹の成虫動物から収集されなければならないということです。
マイオティック染色体広がり製剤は、マイオティック染色体ダイナミクスの主要なシグネチャを調べることができるので、すべてのモデル生物間で染色体ダイナミクスを研究するための重要なツールです。ゼブラフィッシュでは、マイオティックプログラムと核組織の進行の重要な側面は、魚3、4、9、10、12によるタンパク質および/または核酸の免疫蛍光検出のための抗体を用いて、ここで染色体拡散と呼ばれる核表面広がりを探査することによって解剖されてきた。実際、花束中のクラスター化テロメアの偏光局在化は、スプレッド製剤中に保存することができる(図1C)。最近では、ゼブラフィッシュの精子染色体を蛍光検出法や超解像顕微鏡法とともに用い、ゼブラフィッシュテロメアダイナミクス、相同染色体の組み合わせ、二重鎖破壊局在化、および主要なマイオティック遷移におけるシナプスの詳細な進行を解明した。ここではゼブラフィッシュ精巣の精子から発色広がりの染色体を調製し、続いて蛍光ペプチド核酸(PNA)プローブで染色し、染色体関連タンパク質の繰り返しテロメア配列と免疫蛍光検出を行う方法を紹介します。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、ゼブラフィッシュ精巣から分離された精子から広がる核表面におけるテロメアおよび染色体関連タンパク質の位置を探査する方法について説明する。我々は、これらの方法が精巣の大きさに調整して他のテレオスト種の精子細胞の分析に適用可能であることを期待する。
ゼブラフィッシュのマイオティックタンパク質に対して抗体が少ないのに対し、ヒト(h)?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、原稿とアン・グエンに関するコメントに対するトレント・ニューマンとマスダ・シャリフィに感謝します。この作品は、S.M.Bに授与されたNIH R01 GM079115によってサポートされました。
Materials
| 1.5 mL centrifuge tubes | Several commercial brands available | ||
| 1.5 mL microcentrifuge tube rack | Several commercial brands available | ||
| 16% formaldehyde, methanol-free | ThermoFisher Scientific | 28908 | |
| 2 mL | Several commercial brands available | ||
| 24 x 50 mm glass coverslips | Corning | 2980-245 | |
| 24 x 60 mm glasscoverslips | VWR International | 16004-312 | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | ThermoFisher Scientific | 363696 | |
| Autoclave bag | Several commercial brands available | Used to make plastic coverslips. | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1605-100 | Prepare a 100 mg/ml stock solution in sterile distilled water. |
| Cell Strainer, 100 µm | Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| CF405M goat anti-chicken IgY (H+L), highly cross-adsorbed | Biotium | 203775-500uL | Use at 1:1000 |
| Chicken anti-zfSycp1 | Generated by Burgess lab | N/A | Use at 1:100 |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C0130-500MG | |
| Coplin jar | Several commercial brands available | ||
| DNase I, grade II from bovine pancreas | Roche Diagnostics | 10104159001 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Fisher Scientific | MT10014CV | |
| Dumont No. 5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | Two are required for dissecting the testes. |
| Eppendorf Tubes, 5 mL | VWR International | 89429-308 | |
| Formamide | Fisher Scientific | BP228-100 | |
| Goat anti-chicken IgY (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11039 | Use at 1:1000 |
| Goat anti-chicken IgY (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A-11042 | Use at 1:1000 |
| Goat anti-hDMC1 | Santa Cruz Biotechnology | sc-8973 | Does not work in our hands |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11008 | Use at 1:1000 |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A-11012 | Use at 1:1000 |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023-10mL | |
| Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | H3393-100KU | |
| Humidity chamber | Fisher Scientific | 50-112-3683 | |
| Hybridization Oven | VWR International | 230401V (Model 5420) | |
| Incubator Shaker | New Brunswick Scientific | Model Classic C25 | |
| KCl | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Kimwipes | Kimerbly-Clark Professional | 34155 | Used for the humidity chamber |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Microscope | Several commercial brands available | Any standard microscope capable of at least ~1.65X magnification is sufficient. | |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Mouse anti-hamsterSCP3 | Abcam | ab97672 | Does not work in our hands |
| Mouse anti-hMLH1 | BD Biosciences | 550838 | Does not work in our hands |
| Mouse anti-hRPA | Sigma-Alrich | MABE285 | Does not work in our hands |
| Na2HPO4 · 7 H2O | Fisher Scientific | S373-500 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-3 | |
| Photo-Flo 200 solution | Electron Microscopy Sciences | 74257 | |
| Plastic transfer pipettes | Several commercial brands available | ||
| PNA TelC-Alexa647 | PNA Bio Inc | F1013 | Prepare as per manufacturer's instructions. |
| PNA TelC-Cy3 | PNA Bio Inc | F1002 | Prepare as per manufacturer's instructions. |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | ThermoFisher Scientific | P36970 | |
| ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI | ThermoFisher Scientific | P36971 | |
| Rabbit anti-hRPA | Bethyl | A300-244A | Use at 1:300 |
| Rabbit anti-hSCP3 | Abcam | ab150292 | Use at 1:200 |
| Rabbit anti-hRad51 | GeneTex | GTX100469 | Use at 1:300 |
| Sodium citrate | Fisher Scientific | S279-500 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Supercut Scissors, 30° angle, 10 cm | Fisher Scientific | 50-822-353 | Can also use any pair of small scissors. |
| Sylgard kit | Fisher Scientific | NC9897184 | Prepare as per manufacturer's instructions. |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | Dilute in sterile distilled water to make a 20% working solution. Store at room temperature. Triton X-100 forms a precipitate when diluted in water; precipitate dissolves overnight. |
| Trypsin | Worthington Biochemical | LS003708 | |
| Trypsin inhibitor from chicken egg white | Sigma-Aldrich | T9253-500MG | |
| Tween 20 | Bio-Rad | 170-6531 | Dilute in sterile distilled water to make a 20% working solution. Store at room temperature. |
| Vannas Spring Scissors – 4 mm (micro scissors) | Fine Science Tools | 15018-10 |
References
- Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem. Nature Reviews Genetics. 13, 493-504 (2012).
- Zickler, D., Kleckner, N. Recombination, Pairing, and Synapsis of Homologs during Meiosis. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, (2015).
- Blokhina, Y. P., Nguyen, A. D., Draper, B. W., Burgess, S. M. The telomere bouquet is a hub where meiotic double-strand breaks, synapsis, and stable homolog juxtaposition are coordinated in the zebrafish, Danio rerio. PLoS Genetics. 15, e1007730 (2019).
- Saito, K., Sakai, C., Kawasaki, T., Sakai, N. Telomere distribution pattern and synapsis initiation during spermatogenesis in zebrafish. Developmental Dynamics. 243, 1448-1456 (2014).
- Oliver-Bonet, M., Turek, P. J., Sun, F., Ko, E., Martin, R. H. Temporal progression of recombination in human males. Molecular Human Reproduction. 11, 517-522 (2005).
- Gruhn, J. R., Rubio, C., Broman, K. W., Hunt, P. A., Hassold, T. Cytological studies of human meiosis: sex-specific differences in recombination originate at, or prior to, establishment of double-strand breaks. PLoS One. 8, e85075 (2013).
- Pratto, F., et al. Recombination initiation maps of individual human genomes. Science. 346, 1256442 (2014).
- Brown, P. W., et al. Meiotic synapsis proceeds from a limited number of subtelomeric sites in the human male. American Journal of Human Genetics. 77, 556-566 (2005).
- Poss, K. D., Nechiporuk, A., Stringer, K. F., Lee, C., Keating, M. T. Germ cell aneuploidy in zebrafish with mutations in the mitotic checkpoint gene mps1. Genes and Development. 18, 1527-1532 (2004).
- Saito, K., Siegfried, K. R., Nüsslein-Volhard, C., Sakai, N. Isolation and cytogenetic characterization of zebrafish meiotic prophase I mutants. Developmental Dynamics. 240, 1779-1792 (2011).
- Sansam, C. L., Pezza, R. J. Connecting by breaking and repairing: mechanisms of DNA strand exchange in meiotic recombination. Febs Journal. 282, 2444-2457 (2015).
- Feitsma, H., Leal, M. C., Moens, P. B., Cuppen, E., Schulz, R. W. Mlh1 Deficiency in Zebrafish Results in Male Sterility and Aneuploid as Well as Triploid Progeny in Females. 유전학. 175, 1561-1569 (2007).
- Dia, F., Strange, T., Liang, J., Hamilton, J., Berkowitz, K. M. Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Mouse Spermatocytes. Journal of Visualized Experiments. (129), e55378 (2017).
- Moens, P. B. Zebrafish: chiasmata and interference. Genome. 49, 205-208 (2006).
- Lisachov, A. P., Zadesenets, K. S., Rubtsov, N. B., Borodin, P. M. Sex chromosome synapsis and recombination in male guppies. Zebrafish. 12 (2), 174-180 (2015).
- Ocalewicz, K., Mota-Velasco, J. C., Campos-Ramos, R., Penman, D. J. FISH and DAPI staining of the synaptonemal complex of the Nile tilapia (Oreochromis niloticus) allow orientation of the unpaired region of bivalent 1 observed during early pachytene. Chromosome Research. 17 (6), 773 (2009).
