機能的研究のためのEx Vivo加圧海馬毛細血管-パンレンキマル動脈製剤
Summary
本原稿では、海馬動脈と毛細血管をマウス脳から分離する方法と、圧力ミオグラフィー、免疫蛍光、生化学、分子研究のためにそれらを加圧する方法について詳しく説明している。
Abstract
微妙な行動変化から後期型認知症まで、血管認知障害は典型的には脳虚血の後に発症する。脳卒中と心停止は著しく性的に二形性疾患であり、どちらも脳虚血を誘発する。しかしながら、血管認知障害を理解し、その後性特異的な治療法を開発する進歩は、機能研究におけるマウスモデルからの脳微小循環の調査における課題によって部分的に制限されている。ここでは、マウス脳からの生体内海馬毛細血管-毛細血管-毛細血管-毛細血管-毛細血管性動脈(HiCaPA)製剤における毛細血管から動脈へのシグナル伝達を調べるアプローチを提示する。毛細血管刺激に応じて動脈径を測定するために微小循環を分離、カニューレート、加圧する方法について説明する。我々は、HiCaPA調製完全性を検証し、神経血管カップリング剤としてのカリウムの試験および最近特徴付けられたキル2内向き整流カリウムチャネルファミリーML133の効果を含む典型的な結果を表示するために使用できる適切な機能制御を示す。また、雄マウスと雌マウスから得られた調製物中の応答を比較する。これらのデータは機能的な調査を反映していますが、分子生物学、免疫化学、電気生理学の研究にも活用できます。
Introduction
脳表面の膜循環は、実験的なアクセシビリティの一部で、多くの研究の対象となっています。しかし、脳血管系のトポロジーは、異なる領域を作成します。血流をリダイレクトするための実質的な能力を有するアナストモーゼに富む堅牢な膜ネットワークとは対照的に、脳内性脳静脈内動脈(P)は限られた側頭供給を有し、それぞれが神経組織1、2の離散体積を透過する。これは、独特の生理学的特徴3、4、5、6、7、8と組み合わせることで、脳内動脈を脳血流(CBF)調節9、10にする血流にボトルネック効果を生じる。PAの分離およびカンギュレーションに固有の技術的な課題にもかかわらず、過去10年間は、加圧容器11、12、13、14、15、17を使用したex vivo機能研究への関心が高まっています。この関心の高まりの理由の一つは、神経血管カップリング(NVC)に対して行われたかなりの研究努力であり、脳機能性充血18を支持するメカニズムである。
地域的には、CBFは局所神経活性化19に続いて急速に増加することができる。NVCを制御する細胞機構およびシグナル伝達特性は不完全に理解されている。しかし、神経活動を感知し、上流動脈20、21、22を拡張する過分極電気信号に変換する際に、NVC中の脳毛細血管に対する予想外の役割を同定した。作用電位23、24および大導電Ca2+活性化K+(BK)チャネルの星腸エンドフィート25上の大導電率Ca2+活性化K+(BK)チャネルの開口部は、間質カリウムイオン濃度[K+]oを増加させ、その結果、毛細血管の血管内皮における強い内向き整流K+(Kir)チャネルの活性化をもたらす。このチャネルは、外部K+だけでなく、高分極自体によって活性化されます。ギャップ接合部を介して広がる、過分極電流は、その後、動脈まで隣接する毛細血管内皮細胞で再生し、そこで筋細胞弛緩およびCBF増加20、21を引き起こす。このメカニズムの研究は、血管活性剤による毛細血管刺激中に動脈径を測定するための加圧毛細血管-パン酸動脈(CaPA)製剤を開発することにつながりました。CaPA調製物は、無傷の下流の毛細血管の影響を有するカニューレ化された脳内動脈セグメントで構成される。毛細血管端部は、マイクロピペットによってチャンバーガラス底部に対して圧縮され、血管形成全体を閉塞し安定化させる20、21である。
我々は以前、マウス扁桃体13および海馬13、17からマウス皮質20、21および動脈からのCaPA製剤をイメージングすることによって器械的な革新を行った。海馬血管系は病理学的状態に対する感受性から注目を集める中、機能的NVC研究のみならず、分子生物学、免疫化学、電気生理学においても使用できるマウス海馬(HiCaPA)からのCaPA調製方法を段階的に提供します。
Protocol
すべての実験は、コロラド大学アンシュッツメディカルキャンパスの制度動物ケア利用委員会(IACUC)によって承認され、国立衛生研究所のガイドラインに従って行われました。 1. ソリューション 解剖のためにMOPS緩衝生理行を使用し、サンプルを使用する前に4°Cに保ちます。溶液にガスを入ないでください。次の組成でMOPS緩衝生理食合を準備する: 135 mM NaCl, 5 mM KCl…
Representative Results
内皮小導電率(SK)および中間導電率(IK)Ca2+感受性K+チャネルは、CAの直径に拡張的な影響を及ぼす。合成IKおよびSKチャネルアゴニストである1μM NS309の浴適用は、最大膨張に近い原因となった(図2A,B)。しかし、毛細血管内皮細胞はIKおよびSKチャネルを欠き、NS30920に応答して過分極を行わなかった。そ?…
Discussion
本原稿に記載されている加圧されたHiCaPA(海馬毛細血管-パンレンキマル動脈)製剤は、分極化、加圧、および研究性の高い動脈29を分離、加圧、および研究するための確立された手順の延長である。我々は最近、脳毛細血管内皮細胞におけるKir2.1チャネルが神経活性化に関連する[K+]oにおいて感覚が増加し、上流動脈20を拡張する昇順の高い偏光シグ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者たちは、原稿に関する洞察力に満ちたコメントをジュール・モリンに感謝したいと思います。この研究は、CADASIL Together Have Hope非営利団体、女性の健康と研究センター、NHLBI R01HL136636(FD)からの賞によって資金提供されました。
Materials
| 0.22µm Syringe Filters | CELLTREAT Scientific Products | 229751 | |
| 12-0 Nylon (12cm) Black | Microsurgery Instruments, Inc | S12-0 NYLON | |
| Automatic Temperature Controller | Warner Instruments | TC-324B | |
| Borosilicate Glass O.D.: 1.2 mm, I.D.: 0.68 mm | Sutter Instruments | B120-69-10 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| CaCl2 dihydrate | Sigma-Aldrich | C3881 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| Dissection Scope | Olympus | SZ11 | |
| ECOLINE VC-MS/CA 4-12 — complete Pump with Drive and MS/CA 4-12 pump-head | Ismatec | ISM 1090 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| Fine Scissors – Sharp | Fine Science Tools | 14063-09 | |
| Inline Water Heater | Warner Instruments | SH-27B | |
| Integra™ Miltex™Tissue Forceps | Fisher Scientific | 12-460-117 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5379 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | M1880 | |
| MgCl Anhydrous | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Micromanipulator | Narishige | MN-153 | |
| ML 133 hydrochloride | Tocris | 4549 | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9625 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S8875 | |
| NS309 | Tocris | 3895 | |
| Picospritzer III – Intracellular Microinjection Dispense Systems, 2-channel | Parker Hannifin | 052-0500-900 | |
| Pressure Servo Controller with Peristaltic Pump | Living Systems Instrumentation | PS-200 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P3662 | |
| Super Fine Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Surgical Scissors – Sharp-Blunt | Fine Science Tools | 14001-13 | |
| Vertical Micropipette Puller | Narishige | PP-83 |
References
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Cite This Article
Rosehart, A. C., Johnson, A. C., Dabertrand, F. Ex Vivo Pressurized Hippocampal Capillary-Parenchymal Arteriole Preparation for Functional Study. J. Vis. Exp. (154), e60676, doi:10.3791/60676 (2019).