Ex vivo trykbærende Hippocampal kapillar-Parenchymal arteriole forberedelse til funktionel undersøgelse
Summary
Det nuværende manuskript beskriver, hvordan man isolerer hippocampus arterioler og kapillærer fra muse hjernen, og hvordan man presser dem til trykmyografi, immunofluorescens, biokemi og molekylære studier.
Abstract
Fra subtile adfærdsmæssige ændringer til sen-fase demens, vaskulær kognitiv svækkelse typisk udvikler efter cerebral iskæmi. Slagtilfælde og hjertestop er bemærkelsesværdigt seksuelt dimorfe sygdomme, og begge inducere cerebral iskæmi. Men, fremskridt i forståelsen af vaskulær kognitiv svækkelse, og derefter udvikle kønsspecifikke behandlinger, har været delvist begrænset af udfordringer i at undersøge hjernen mikrocirkulationen fra musemodeller i funktionelle undersøgelser. Her præsenterer vi en tilgang til at undersøge kapillær-til-arteriole signalering i en ex vivo hippocampus kapillar-parenchymal arteriole (hicapa) forberedelse fra mus hjernen. Vi beskriver, hvordan man isolerer, kanyle og under tryk mikrocirkulationen for at måle arteriolær diameter som respons på kapillær stimulation. Vi viser, hvilke passende funktionelle Kontroller der kan bruges til at validere HiCaPA-præparatets integritet og vise typiske resultater, herunder test af kalium som et Neuro vaskulær koblingsmiddel og effekten af den nyligt karakteriserede inhibitor af Kir2 aktiv rektificerende kalium kanal familie, ML133. Desuden sammenligner vi svarene i præparater opnået fra mandlige og kvindelige mus. Selv om disse data afspejler funktionelle undersøgelser, kan vores tilgang også anvendes i molekylær biologi, immunokemi og Elektrofysiologi undersøgelser.
Introduction
Den piale cirkulation på overfladen af hjernen har været genstand for megen undersøgelse, dels på grund af dens eksperimentelle tilgængelighed. Men topologi af den cerebrale Vaskulaturen skaber særskilte regioner. I modsætning til den robuste Pial netværk rig på anastomoser med betydelig kapacitet til at omdirigere blodgennemstrømningen, intracerebral parenkymal arterioler (pas) nuværende begrænset sikkerhedsstillelse, hver af dem perfusing en diskret volumen af nervevæv1,2. Dette skaber en flaskehals effekt på blodgennemstrømningen, som kombineret med unikke fysiologiske funktioner3,4,5,6,7,8, gør intracerebral arterioler et afgørende sted for cerebral blodgennemstrømning (CBF) regel9,10. På trods af de tekniske udfordringer, som er forbundet med isolation og annullering af pas, har det sidste årti oplevet en øget interesse for ex vivo -funktionelle undersøgelser med trykbeholdere11,12,13,14,15,16,17. En af grundene til denne øgede interesse er den betydelige forskningsindsats, der udføres på neurovaskulære kobling (NVC), mekanismen opretholde hjernen funktionelle hyperæmi18.
Regionalt kan CBF hurtigt stige efter lokal neurale aktivering19. De cellulære mekanismer og signalerings egenskaber, der styrer NVC, er ufuldstændigt forstået. Men vi identificerede en tidligere uventet rolle for hjernen kapillærer under NVC i sensing neurale aktivitet og omsætte det til et hyperpolariserende elektrisk signal til spile opstrøms arterioler20,21,22. Action potentialer23,24 og åbning af store-ledning ca2 +-aktiverede k+ (BK) kanaler på astrocytiske endfeet25,26 øge den interstitiel kalium ionkoncentration [K+]o, hvilket resulterer i aktivering af stærke indadgående ensretter k+ (Kir) kanaler i den vaskulære endotelum af kapillærer. Denne kanal er aktiveret af ekstern K+ , men også af hyperpolarisering selv. Ved at sprede sig gennem Gap-kryds, regenererer hyperpolariserende strøm i tilstødende kapillar endotelceller op til arterien, hvor det forårsager nekrotiske afslapning og CBF øger20,21. Studiet af denne mekanisme fik os til at udvikle et trykbærende kapillar-parenchymal arteriole (CaPA) præparat til måling af arteriolær diameter under kapillær stimulation med vasoaktive stoffer. CaPA-præparatet består af et cannuleret intracerebral arteriole segment med en intakt, nedstrøms kapillær forgreningen. Kapillar enderne komprimeres mod kammer glasbunden med en mikropipette, som tilstopper og stabiliserer hele vaskulære dannelsen20,21.
Vi har tidligere lavet instrumental innovationer af Imaging Capa præparater fra Mouse cortex20,21 og arterioler fra rat amygdala13 og hippocampus16,17. Som hippocampus Vaskulaturen modtager mere opmærksomhed på grund af dens modtagelighed for patologiske tilstande, her giver vi en trin-for-trin metode til CaPA forberedelse fra musen hippocampus (HiCaPA), der ikke kun kan anvendes i funktionelle NVC undersøgelser, men også i molekylær biologi, immunkemi, og Elektrofysiologi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det trykbærende hicapa (hippocampus kapillar-parenkymal arteriole), der er beskrevet i dette manuskript, er en udvidelse af vores veletablerede procedure til at isolere, under tryk og studere parenkymal arterioler29. Vi rapporterede for nylig, at KIR 2.1 kanaler i hjernen kapillar endotelceller Sense stigninger i [K+]o forbundet med neurale aktivering, og generere et stigende hyperpolariserende signal, der udvider upstream arterioler20. Afslører denn…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne takke Jules Morin for indsigtsfulde kommentarer til manuskriptet. Denne forskning blev finansieret af Awards fra CADASIL sammen har vi håbet non-profit organisation, Center for Women’s Health and Research, og NHLBI R01HL136636 (FD).
Materials
| 0.22µm Syringe Filters | CELLTREAT Scientific Products | 229751 | |
| 12-0 Nylon (12cm) Black | Microsurgery Instruments, Inc | S12-0 NYLON | |
| Automatic Temperature Controller | Warner Instruments | TC-324B | |
| Borosilicate Glass O.D.: 1.2 mm, I.D.: 0.68 mm | Sutter Instruments | B120-69-10 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| CaCl2 dihydrate | Sigma-Aldrich | C3881 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| Dissection Scope | Olympus | SZ11 | |
| ECOLINE VC-MS/CA 4-12 — complete Pump with Drive and MS/CA 4-12 pump-head | Ismatec | ISM 1090 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| Fine Scissors – Sharp | Fine Science Tools | 14063-09 | |
| Inline Water Heater | Warner Instruments | SH-27B | |
| Integra™ Miltex™Tissue Forceps | Fisher Scientific | 12-460-117 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5379 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | M1880 | |
| MgCl Anhydrous | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Micromanipulator | Narishige | MN-153 | |
| ML 133 hydrochloride | Tocris | 4549 | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9625 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S8875 | |
| NS309 | Tocris | 3895 | |
| Picospritzer III – Intracellular Microinjection Dispense Systems, 2-channel | Parker Hannifin | 052-0500-900 | |
| Pressure Servo Controller with Peristaltic Pump | Living Systems Instrumentation | PS-200 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P3662 | |
| Super Fine Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Surgical Scissors – Sharp-Blunt | Fine Science Tools | 14001-13 | |
| Vertical Micropipette Puller | Narishige | PP-83 |
References
- Nishimura, N., Schaffer, C. B., Friedman, B., Lyden, P. D., Kleinfeld, D. Penetrating arterioles are a bottleneck in the perfusion of neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (1), 365-370 (2007).
- Shih, A. Y., et al. Robust and fragile aspects of cortical blood flow in relation to the underlying angioarchitecture. Microcirculation (New York, N.Y.:1994). 22 (3), 204-218 (2015).
- Cipolla, M. J., Smith, J., Kohlmeyer, M. M., Godfrey, J. A. SKCa and IKCa Channels, Myogenic Tone, and Vasodilator Responses in Middle Cerebral Arteries and Parenchymal Arterioles: Effect of Ischemia and Reperfusion. Stroke. 40 (4), 1451-1457 (2009).
- Nystoriak, M. A., et al. Fundamental increase in pressure-dependent constriction of brain parenchymal arterioles from subarachnoid hemorrhage model rats due to membrane depolarization. AJP: Heart and Circulatory Physiology. 300 (3), H803-H812 (2011).
- Dabertrand, F., Nelson, M. T., Brayden, J. E. Acidosis dilates brain parenchymal arterioles by conversion of calcium waves to sparks to activate BK channels. Circulation Research. 110 (2), 285-294 (2012).
- Dabertrand, F., Nelson, M. T., Brayden, J. E. Ryanodine receptors, calcium signaling, and regulation of vascular tone in the cerebral parenchymal microcirculation. Microcirculation (New York, N.Y.:1994). 20 (4), 307-316 (2013).
- Cipolla, M. J., et al. Increased pressure-induced tone in rat parenchymal arterioles vs. middle cerebral arteries: role of ion channels and calcium sensitivity. Journal of Applied Physiology. 117 (1), 53-59 (2014).
- De Silva, T. M., Modrick, M. L., Dabertrand, F., Faraci, F. M. Changes in Cerebral Arteries and Parenchymal Arterioles with Aging: Role of Rho Kinase 2 and Impact of Genetic Background. Hypertension. 71 (5), 921-927 (2018).
- Shih, A. Y., et al. The smallest stroke: occlusion of one penetrating vessel leads to infarction and a cognitive deficit. Nature Neuroscience. 16 (1), 55-63 (2013).
- Koide, M., et al. The yin and yang of KV channels in cerebral small vessel pathologies. Microcirculation (New York, N.Y.:1994). 25 (1), (2018).
- Girouard, H., et al. Astrocytic endfoot Ca2+ and BK channels determine both arteriolar dilation and constriction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3811-3816 (2010).
- Dabertrand, F., et al. Prostaglandin E2, a postulated astrocyte-derived neurovascular coupling agent, constricts rather than dilates parenchymal arterioles. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 33 (4), 479-482 (2013).
- Longden, T. A., Dabertrand, F., Hill-Eubanks, D. C., Hammack, S. E., Nelson, M. T. Stress-induced glucocorticoid signaling remodels neurovascular coupling through impairment of cerebrovascular inwardly rectifying K+ channel function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (20), 7462-7467 (2014).
- Dabertrand, F., et al. Potassium channelopathy-like defect underlies early-stage cerebrovascular dysfunction in a genetic model of small vessel disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (7), E796-E805 (2015).
- Pires, P. W., Sullivan, M. N., Pritchard, H. A. T., Robinson, J. J., Earley, S. Unitary TRPV3 channel Ca2+ influx events elicit endothelium-dependent dilation of cerebral parenchymal arterioles. AJP: Heart and Circulatory Physiology. 309 (12), H2031-H2041 (2015).
- Johnson, A. C., Cipolla, M. J. Altered hippocampal arteriole structure and function in a rat model of preeclampsia: Potential role in impaired seizure-induced hyperemia. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 37 (8), 2857-2869 (2016).
- Johnson, A. C., Miller, J. E., Cipolla, M. J. Memory impairment in spontaneously hypertensive rats is associated with hippocampal hypoperfusion and hippocampal vascular dysfunction. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. , (2019).
- Iadecola, C. The Neurovascular Unit Coming of Age: A Journey through Neurovascular Coupling in Health and Disease. Neuron. 96 (1), 17-42 (2017).
- Roy, C. S., Sherrington, C. S. On the Regulation of the Blood-supply of the Brain. The Journal of Physiology. 11 (1-2), 85-158 (1890).
- Longden, T. A., et al. Capillary K+-sensing initiates retrograde hyperpolarization to increase local cerebral blood flow. Nature Neuroscience. 20 (5), 717-726 (2017).
- Harraz, O. F., Longden, T. A., Dabertrand, F., Hill-Eubanks, D., Nelson, M. T. Endothelial GqPCR activity controls capillary electrical signaling and brain blood flow through PIP2 depletion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (15), E3569-E3577 (2018).
- Harraz, O. F., Longden, T. A., Hill-Eubanks, D., Nelson, M. T. PIP2 depletion promotes TRPV4 channel activity in mouse brain capillary endothelial cells. eLife. 7, 351 (2018).
- Hodgkin, A. L., Huxley, A. F. A quantitative description of membrane current and its application to conduction and excitation in nerve. The Journal of Physiology. 117 (4), 500-544 (1952).
- Ballanyi, K., Doutheil, J., Brockhaus, J. Membrane potentials and microenvironment of rat dorsal vagal cells in vitro during energy depletion. The Journal of Physiology. 495 (Pt 3), 769-784 (1996).
- Filosa, J. A., et al. Local potassium signaling couples neuronal activity to vasodilation in the brain. Nature Neuroscience. 9 (11), 1397-1403 (2006).
- Attwell, D., et al. Glial and neuronal control of brain blood flow. Nature. 468 (7321), 232-243 (2010).
- Coyle, P. Vascular patterns of the rat hippocampal formation. Experimental Neurology. 52 (3), 447-458 (1976).
- Wang, H. R., et al. Selective inhibition of the K(ir)2 family of inward rectifier potassium channels by a small molecule probe: the discovery, SAR, and pharmacological characterization of ML133. ACS Chemical Biology. 6 (8), 845-856 (2011).
- Pires, P. W., Dabertrand, F., Earley, S. Isolation and Cannulation of Cerebral Parenchymal Arterioles. Journal of Visualized Experiments. (111), 1-11 (2016).
- Bayliss, W. M. On the local reactions of the arterial wall to changes of internal pressure. The Journal of Physiology. 28 (3), 220-231 (1902).
- Montagne, A., et al. Blood-brain barrier breakdown in the aging human hippocampus. Neuron. 85 (2), 296-302 (2015).
- Zhang, X., et al. Circulating heparin oligosaccharides rapidly target the hippocampus in sepsis, potentially impacting cognitive functions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (19), 9208-9213 (2019).
- Kim, K. J., Filosa, J. A. Advanced in vitro approach to study neurovascular coupling mechanisms in the brain microcirculation. The Journal of Physiology. 590 (7), 1757-1770 (2012).
