Ex vivo onder druk Hippocampal capillaire-parenchymale Arteriole voorbereiding voor functionele studie
Summary
Het huidige manuscript laat zien hoe hippocampal arteriolen en haarvaten van de muis hersenen isoleren en hoe ze onder druk kunnen worden gezet voor myografie, immunofluorescentie, biochemie en moleculaire studies.
Abstract
Van subtiele gedragsveranderingen tot laattijdige dementie ontwikkelt vasculaire cognitieve stoornissen zich meestal na cerebrale ischemie. Beroerte en hartstilstand zijn opmerkelijk seksueel dimorfe ziekten, en beide induceren cerebrale ischemie. Echter, vooruitgang in het begrijpen van de vasculaire cognitieve stoornissen, en vervolgens het ontwikkelen van seks-specifieke behandelingen, is deels beperkt door uitdagingen bij het onderzoeken van de hersenen microcirculatie van Muismodellen in functionele studies. Hier presenteren we een benadering om de capillaire-naar-Arteriole-signalering te onderzoeken in een ex vivo hippocampal capillaire-parenchymale Arteriole (hicapa) voorbereiding van muizenhersenen. We beschrijven hoe de microcirculatie te isoleren, te cannuleren en onder druk te zetten om de arteriolaire diameter te meten als reactie op capillaire stimulatie. We laten zien welke geschikte functionele controles kunnen worden gebruikt om de integriteit van de voorbereiding van de HiCaPA te valideren en typische resultaten weer te geven, waaronder het testen van kalium als een neurovasculaire koppelings agent en het effect van de recentelijk gekarakteriseerde remmer van de Kir2 actieve gelijkrichter kaliumkanaal familie, ML133. Verder vergelijken we de reacties in preparaten die zijn verkregen van mannelijke en vrouwelijke muizen. Hoewel deze gegevens functioneel onderzoek weerspiegelen, kan onze aanpak ook worden gebruikt in moleculaire biologie, Immunochemie en elektrofysiologie studies.
Introduction
De Piale circulatie op het oppervlak van de hersenen is het voorwerp geweest van veel studie, deels vanwege de experimentele toegankelijkheid. Echter, de topologie van de cerebrale vasculatuur creëert verschillende regio’s. In tegenstelling tot het robuuste pial-netwerk dat rijk is aan anastomosen met aanzienlijke capaciteit voor het omleiden van de bloedstroom, presenteren de intracerebrale parenchymale arteriolen (PAs) beperkte onderpand toevoer, elk met een discrete hoeveelheid zenuwweefsel1,2. Dit creëert een knelpunt effect op de bloedstroom die, in combinatie met unieke fysiologische kenmerken3,4,5,6,7,8, maakt intracerebrale arteriolen een cruciale plaats voor de cerebrale doorbloeding (CBF) voorschrift9,10. Ondanks de technische uitdagingen die inherent zijn aan de isolatie en de cannulatie van PAs, heeft de laatste tien jaar een toegenomen belangstelling voor ex-vivo -functionele studies met onder druk staande schepen11,12,13,14,15,16,17. Een van de redenen voor deze toegenomen belangstelling is de aanzienlijke onderzoeksinspanningen uitgevoerd op neurovasculaire koppeling (NVC), het mechanisme ondersteunen van de hersenen functionele hyperemie18.
Regionaal, CBF kan snel toenemen na lokale neurale activering19. De cellulaire mechanismen en signalering eigenschappen die NVC beheersen zijn niet volledig begrepen. Echter, we identificeerden een eerder onverwachte rol voor de hersen capillairen tijdens NVC in sensing neurale activiteit en vertalen in een hyperpolariserende elektrische signaal te verwijden stroomopwaarts arteriolen20,21,22. Actie potentialen23,24 en opening van grote-conductance CA2 +-geactiveerde K+ (BK) kanalen op de astrocytische endfeet25,26 Verhoog de concentratie van de interstitiële kalium ionen [K+]o, wat resulteert in de activering van sterke inkomende gelijkrichter K+ (KIR) kanalen in het vasculaire endotheel van de capillairen. Dit kanaal wordt geactiveerd door externe K+ , maar ook door hyperpolarisatie zelf. De hyperpolariserende stroom verspreidt zich door tussenruimte kruisingen en regenereert vervolgens in aangrenzende capillaire endotheliale cellen tot aan de Arteriole, waar het myocyten ontspanning en CBF verhoogt20,21. De studie van dit mechanisme leidde ons tot het ontwikkelen van een onder druk staande capillaire-parenchymale Arteriole (CaPA) voorbereiding voor het meten van de arteriollaire diameter tijdens capillaire stimulatie met vasoactieve agentia. De capa preparaat is samengesteld uit een gecanuleerde intracerebrale Arteriole segment met een intact, downstream capillaire vertachting. De capillaire uiteinden worden gecomprimeerd tegen de kamer glazen bodem door een micro Pipet, die de gehele vasculaire vorming20,21occludeert en stabiliseert.
Eerder maakten we instrumentale innovaties door Imaging Capa-preparaten uit de muis cortex20,21 en arteriolen van de rat amygdala13 en Hippocampus16,17. Aangezien de hippocampal therapieën meer aandacht krijgt vanwege de gevoeligheid voor pathologische omstandigheden, bieden we hier een stapsgewijze methode voor Capa-bereiding van de muis Hippocampus (hicapa) die niet alleen kan worden gebruikt in functionele NVC-studies, maar ook in moleculaire biologie, Immunochemie en elektrofysiologie.
Protocol
Representative Results
Discussion
De onder druk staande hicapa (hippocampal capillaire-parenchymale Arteriole) voorbereiding beschreven in het huidige manuscript is een Verleng teken van onze gevestigde procedure om parenchymale arteriolen29te isoleren, onder druk te zetten en te bestuderen. We onlangs gemeld dat Kir 2.1 kanalen in hersen capillaire endotheliale cellen Sense toeneemt in [K+]o geassocieerd met neurale activering, en het genereren van een stijgende hyperpolariserende signaal dat stroomopwaarts …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen Jules Morin bedanken voor de inzichtelijke opmerkingen over het manuscript. Dit onderzoek werd gefinancierd door Awards van de CADASIL samen hebben we hoop non-profit organisatie, het centrum voor de gezondheid van vrouwen en onderzoek, en de NHLBI R01HL136636 (FD).
Materials
| 0.22µm Syringe Filters | CELLTREAT Scientific Products | 229751 | |
| 12-0 Nylon (12cm) Black | Microsurgery Instruments, Inc | S12-0 NYLON | |
| Automatic Temperature Controller | Warner Instruments | TC-324B | |
| Borosilicate Glass O.D.: 1.2 mm, I.D.: 0.68 mm | Sutter Instruments | B120-69-10 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| CaCl2 dihydrate | Sigma-Aldrich | C3881 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| Dissection Scope | Olympus | SZ11 | |
| ECOLINE VC-MS/CA 4-12 — complete Pump with Drive and MS/CA 4-12 pump-head | Ismatec | ISM 1090 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| Fine Scissors – Sharp | Fine Science Tools | 14063-09 | |
| Inline Water Heater | Warner Instruments | SH-27B | |
| Integra™ Miltex™Tissue Forceps | Fisher Scientific | 12-460-117 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5379 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | M1880 | |
| MgCl Anhydrous | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Micromanipulator | Narishige | MN-153 | |
| ML 133 hydrochloride | Tocris | 4549 | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9625 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S8875 | |
| NS309 | Tocris | 3895 | |
| Picospritzer III – Intracellular Microinjection Dispense Systems, 2-channel | Parker Hannifin | 052-0500-900 | |
| Pressure Servo Controller with Peristaltic Pump | Living Systems Instrumentation | PS-200 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P3662 | |
| Super Fine Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Surgical Scissors – Sharp-Blunt | Fine Science Tools | 14001-13 | |
| Vertical Micropipette Puller | Narishige | PP-83 |
References
- Nishimura, N., Schaffer, C. B., Friedman, B., Lyden, P. D., Kleinfeld, D. Penetrating arterioles are a bottleneck in the perfusion of neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (1), 365-370 (2007).
- Shih, A. Y., et al. Robust and fragile aspects of cortical blood flow in relation to the underlying angioarchitecture. Microcirculation (New York, N.Y.:1994). 22 (3), 204-218 (2015).
- Cipolla, M. J., Smith, J., Kohlmeyer, M. M., Godfrey, J. A. SKCa and IKCa Channels, Myogenic Tone, and Vasodilator Responses in Middle Cerebral Arteries and Parenchymal Arterioles: Effect of Ischemia and Reperfusion. Stroke. 40 (4), 1451-1457 (2009).
- Nystoriak, M. A., et al. Fundamental increase in pressure-dependent constriction of brain parenchymal arterioles from subarachnoid hemorrhage model rats due to membrane depolarization. AJP: Heart and Circulatory Physiology. 300 (3), H803-H812 (2011).
- Dabertrand, F., Nelson, M. T., Brayden, J. E. Acidosis dilates brain parenchymal arterioles by conversion of calcium waves to sparks to activate BK channels. Circulation Research. 110 (2), 285-294 (2012).
- Dabertrand, F., Nelson, M. T., Brayden, J. E. Ryanodine receptors, calcium signaling, and regulation of vascular tone in the cerebral parenchymal microcirculation. Microcirculation (New York, N.Y.:1994). 20 (4), 307-316 (2013).
- Cipolla, M. J., et al. Increased pressure-induced tone in rat parenchymal arterioles vs. middle cerebral arteries: role of ion channels and calcium sensitivity. Journal of Applied Physiology. 117 (1), 53-59 (2014).
- De Silva, T. M., Modrick, M. L., Dabertrand, F., Faraci, F. M. Changes in Cerebral Arteries and Parenchymal Arterioles with Aging: Role of Rho Kinase 2 and Impact of Genetic Background. Hypertension. 71 (5), 921-927 (2018).
- Shih, A. Y., et al. The smallest stroke: occlusion of one penetrating vessel leads to infarction and a cognitive deficit. Nature Neuroscience. 16 (1), 55-63 (2013).
- Koide, M., et al. The yin and yang of KV channels in cerebral small vessel pathologies. Microcirculation (New York, N.Y.:1994). 25 (1), (2018).
- Girouard, H., et al. Astrocytic endfoot Ca2+ and BK channels determine both arteriolar dilation and constriction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3811-3816 (2010).
- Dabertrand, F., et al. Prostaglandin E2, a postulated astrocyte-derived neurovascular coupling agent, constricts rather than dilates parenchymal arterioles. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 33 (4), 479-482 (2013).
- Longden, T. A., Dabertrand, F., Hill-Eubanks, D. C., Hammack, S. E., Nelson, M. T. Stress-induced glucocorticoid signaling remodels neurovascular coupling through impairment of cerebrovascular inwardly rectifying K+ channel function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (20), 7462-7467 (2014).
- Dabertrand, F., et al. Potassium channelopathy-like defect underlies early-stage cerebrovascular dysfunction in a genetic model of small vessel disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (7), E796-E805 (2015).
- Pires, P. W., Sullivan, M. N., Pritchard, H. A. T., Robinson, J. J., Earley, S. Unitary TRPV3 channel Ca2+ influx events elicit endothelium-dependent dilation of cerebral parenchymal arterioles. AJP: Heart and Circulatory Physiology. 309 (12), H2031-H2041 (2015).
- Johnson, A. C., Cipolla, M. J. Altered hippocampal arteriole structure and function in a rat model of preeclampsia: Potential role in impaired seizure-induced hyperemia. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 37 (8), 2857-2869 (2016).
- Johnson, A. C., Miller, J. E., Cipolla, M. J. Memory impairment in spontaneously hypertensive rats is associated with hippocampal hypoperfusion and hippocampal vascular dysfunction. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. , (2019).
- Iadecola, C. The Neurovascular Unit Coming of Age: A Journey through Neurovascular Coupling in Health and Disease. Neuron. 96 (1), 17-42 (2017).
- Roy, C. S., Sherrington, C. S. On the Regulation of the Blood-supply of the Brain. The Journal of Physiology. 11 (1-2), 85-158 (1890).
- Longden, T. A., et al. Capillary K+-sensing initiates retrograde hyperpolarization to increase local cerebral blood flow. Nature Neuroscience. 20 (5), 717-726 (2017).
- Harraz, O. F., Longden, T. A., Dabertrand, F., Hill-Eubanks, D., Nelson, M. T. Endothelial GqPCR activity controls capillary electrical signaling and brain blood flow through PIP2 depletion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (15), E3569-E3577 (2018).
- Harraz, O. F., Longden, T. A., Hill-Eubanks, D., Nelson, M. T. PIP2 depletion promotes TRPV4 channel activity in mouse brain capillary endothelial cells. eLife. 7, 351 (2018).
- Hodgkin, A. L., Huxley, A. F. A quantitative description of membrane current and its application to conduction and excitation in nerve. The Journal of Physiology. 117 (4), 500-544 (1952).
- Ballanyi, K., Doutheil, J., Brockhaus, J. Membrane potentials and microenvironment of rat dorsal vagal cells in vitro during energy depletion. The Journal of Physiology. 495 (Pt 3), 769-784 (1996).
- Filosa, J. A., et al. Local potassium signaling couples neuronal activity to vasodilation in the brain. Nature Neuroscience. 9 (11), 1397-1403 (2006).
- Attwell, D., et al. Glial and neuronal control of brain blood flow. Nature. 468 (7321), 232-243 (2010).
- Coyle, P. Vascular patterns of the rat hippocampal formation. Experimental Neurology. 52 (3), 447-458 (1976).
- Wang, H. R., et al. Selective inhibition of the K(ir)2 family of inward rectifier potassium channels by a small molecule probe: the discovery, SAR, and pharmacological characterization of ML133. ACS Chemical Biology. 6 (8), 845-856 (2011).
- Pires, P. W., Dabertrand, F., Earley, S. Isolation and Cannulation of Cerebral Parenchymal Arterioles. Journal of Visualized Experiments. (111), 1-11 (2016).
- Bayliss, W. M. On the local reactions of the arterial wall to changes of internal pressure. The Journal of Physiology. 28 (3), 220-231 (1902).
- Montagne, A., et al. Blood-brain barrier breakdown in the aging human hippocampus. Neuron. 85 (2), 296-302 (2015).
- Zhang, X., et al. Circulating heparin oligosaccharides rapidly target the hippocampus in sepsis, potentially impacting cognitive functions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (19), 9208-9213 (2019).
- Kim, K. J., Filosa, J. A. Advanced in vitro approach to study neurovascular coupling mechanisms in the brain microcirculation. The Journal of Physiology. 590 (7), 1757-1770 (2012).
