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신경과학

Ex Vivo 가압 해모골 모세관-Parenchymal Arteriole 기능 적 연구를 위한 준비

Published: December 18, 2019
doi:
10.3791/60676
, ,
1Department of Anesthesiology,University of Colorado Anschutz Medical Campus, 2Department of Neurological Sciences,University of Vermont Larner College of Medicine, 3Department of Pharmacology,University of Colorado Anschutz Medical Campus

Summary

본 원고는 마우스 뇌에서 해마 동맥과 모세 혈관을 분리하는 방법과 압력 myography, 면역 형광, 생화학 및 분자 연구를 위해 그들을 가압하는 방법을 자세히 설명합니다.

Abstract

미묘한 행동 변경에서 말기 치매에, 혈관 인식 손상은 전형적으로 대뇌 허혈 다음 발전합니다. 뇌졸중과 심장 마비는 현저하게 성적으로 이형질환이며, 둘 다 대뇌 허혈을 유발합니다. 그러나, 혈관 인지 장애를 이해 하 고 다음 성 별 치료를 개발에 진행, 기능 연구에서 마우스 모델에서 뇌 미세 순환을 조사에 의해 부분적으로 제한 되었습니다. 여기에서, 우리는 마우스 두뇌에서 전 생체 내 해모모세-자영-자영 아테리올(HiCaPA) 준비에서 모세관-아티올 신호신호를 검사하는 접근법을 제시한다. 우리는 모세관 자극에 응하여 동맥 직경을 측정하기 위하여 미세 순환을 분리, 통조림 및 가압하는 방법을 기술합니다. 우리는 HiCaPA 제제 무결성을 검증하고 신경 혈관 커플링 제로 칼륨을 테스트하고 Kir2 안쪽정류 칼륨 채널 패밀리, ML133의 최근 특징 억제제의 효과를 포함하여 전형적인 결과를 표시하는 데 사용할 수있는 적절한 기능 적 제어를 보여줍니다. 또한, 우리는 남성과 여성 마우스로부터 수득된 제제에서의 반응을 비교한다. 이러한 데이터는 기능적 조사를 반영하는 반면, 우리의 접근 방식은 분자 생물학, 면역 화학 및 전기 생리학 연구에서도 사용될 수 있습니다.

Introduction

뇌 표면의 pial 순환은 많은 연구의 대상이되었습니다, 부분적으로 때문에 실험 접근성. 그러나 대뇌 혈관 구조의 토폴로지는 뚜렷한 영역을 만듭니다. 혈류를 리디렉션하기위한 실질적인 용량을 가진 해부학이 풍부한 견고한 pial 네트워크와는 달리, 내측 중골 동맥 동맥 (PA)은 제한된 부수적 공급을 제시하며, 이들 각각은 신경 조직의 개별 부피를교배1,2. 이것은 독특한 생리적 특징3,4,5,6,7,8과결합하여 뇌혈류(CBF) 조절9,10을위한 중요한 부위로 뇌내 동맥을 만드는 혈류에 병목 현상 효과를 일으킨다. PA의 격리 및 통조림에 내재된 기술적 과제에도 불구하고, 지난 10년 동안 가압용기11,12,13,14,15,16,17을이용한 생체내 기능연구에 대한 관심이 높아지고 있다. 이러한 관심증가에 대한 이유 중 하나는 뇌 기능성 충혈을 지지하는 기전인 신경혈관 커플링(NVC)에 대한 상당한 연구 노력이 수행된 것이다18.

지역적으로, CBF는 현지 신경 활성화19에따라 급속하게 증가할 수 있다. NVC를 제어하는 셀룰러 메커니즘 및 신호 특성은 불완전하게 이해됩니다. 그러나, 우리는 신경 활동을 감지하고 상류 동맥20,21,22를팽창시키기 위하여 과극화 전기 신호로 번역하는 NVC 도중 두뇌 모세혈관을 위한 이전에 예기치 않은 역할을 확인했습니다. 행동 전위23,24 및 성상 세포 종받에 큰 전도도Ca2+활성화 된 K+ (BK) 채널의 개방25,26 간질 칼륨 이온 농도 [K+]o,이는 모세 혈관내 혈관 내 내 정류기 K+ (Kir) 채널의 활성화를 초래한다. 이 채널은 외부 K+에 의해뿐만 아니라 과분극 자체에 의해 활성화됩니다. 갭 접합을 통해 확산, 과분극 전류는 근세포 이완 및 CBF 증가20,21원인 arteriole까지 인접한 모세관 내피 세포에서 재생. 이 기계장치의 연구 결과는 혈관 활성에이전트를 가진 모세관 자극 도중 동맥 직경을 측정하기 위하여 가압 모세관-parenchymal arteriole (CaPA) 준비를 개발하기 위하여 저희를 지도했습니다. CaPA 제제는 손상되지 않은 하류 모세관 파급 효과를 가진 굴절식 중계 동맥 분절로 구성됩니다. 모세관 끝은 마이크로피펫에 의해 챔버 유리 바닥에 압축되며, 이는 전체 혈관형성을 20,21로막고 안정화시킵니다.

우리는 이전에 쥐 편도체 13 및 해마16, 17에서마우스 피질20,21 및 동맥에서 CaPA 제제를 이미징하여 도구적 혁신을 이루었다. 해마 혈관구조는 병리학적 조건에 대한 감수성으로 인해 더 많은 관심을 받고 있기 때문에, 여기서 우리는 기능적 NVC 연구뿐만 아니라 분자 생물학, 면역 화학 및 전기 생리학에서도 사용할 수있는 마우스 해마 (HiCaPA)에서 CaPA 준비를위한 단계별 방법을 제공합니다.

Protocol

모든 실험은 콜로라도 대학, 안슈츠 의료 캠퍼스의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었으며 국립 보건원의 지침에 따라 수행되었습니다. 1. 솔루션 해부를 위해 MOPS 버퍼링 식염수를 사용하고 시료를 사용 전에 4 °C로 유지하십시오. 용액을 가스로 사용하지 마십시오. 다음 조성으로 MOPS 완충 식염수 준비: 135 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM KH2PO4,1 mM…

Representative Results

내피 소형 전도도 (SK) 및 중간 전도도 (IK) Ca2 +-민감한 K+ 채널은 PA의 직경에 경악영향을 미칩니다. 1 μM NS309의 목욕 적용, 합성 IK 및 SK 채널 작용제, 거의 최대 팽창 발생(그림 2A,B). 그러나, 모세관 내피 세포는 IK 및 SK 채널이 부족하고 NS30920에대한 반응으로 과분극화되지 않았다. 그 결과, 모세관을 자극?…

Discussion

본 원고에 기재된 가압 HiCaPA(해모세혈관-자영형 동맥) 제제는 중증 모낭 동맥 을 분리, 가압 및 연구하기 위한 당사의 잘 확립된 절차의 연장체이다29. 최근 뇌 모세관 내피 세포에서 Kir2.1 채널이 신경 활성화와 관련된 [K+]o에서 감각이 증가하고, 상류 동맥20을팽창시키는 오름차순 과극성 신호를 생성한다고 보고하였다. 모세 혈관에 대한 이전에…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

저자는 원고에 대한 통찰력있는 의견에 줄스 모린에게 감사드립니다. 이 연구는 CADASIL 함께 우리는 희망 비영리 단체, 여성 건강 및 연구 센터, NHLBI R01HL136636 (FD)에서 상에 의해 투자되었다.

Materials

0.22µm Syringe Filters CELLTREAT Scientific Products 229751
12-0 Nylon (12cm) Black Microsurgery Instruments, Inc S12-0 NYLON
Automatic Temperature Controller Warner Instruments TC-324B
Borosilicate Glass O.D.: 1.2 mm, I.D.: 0.68 mm Sutter Instruments B120-69-10
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A7030
CaCl2 dihydrate Sigma-Aldrich C3881
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G5767
Dissection Scope Olympus SZ11
ECOLINE VC-MS/CA 4-12 — complete Pump with Drive and MS/CA 4-12 pump-head Ismatec ISM 1090
EGTA Sigma-Aldrich E4378
Fine Scissors – Sharp Fine Science Tools 14063-09
Inline Water Heater Warner Instruments SH-27B
Integra™ Miltex™Tissue Forceps Fisher Scientific 12-460-117
KCl Sigma-Aldrich P9333
KH2PO4 Sigma-Aldrich P5379
Magnesium sulfate heptahydrate Sigma-Aldrich M1880
MgCl Anhydrous Sigma-Aldrich M8266
Micromanipulator Narishige MN-153
ML 133 hydrochloride Tocris 4549
MOPS Sigma-Aldrich M1254
NaCl Sigma-Aldrich S9625
NaH2PO4 Sigma-Aldrich S9638
NaHCO3 Sigma-Aldrich S8875
NS309 Tocris 3895
Picospritzer III – Intracellular Microinjection Dispense Systems, 2-channel Parker Hannifin 052-0500-900
Pressure Servo Controller with Peristaltic Pump Living Systems Instrumentation PS-200
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich P3662
Super Fine Forceps Fine Science Tools 11252-20
Surgical Scissors – Sharp-Blunt Fine Science Tools 14001-13
Vertical Micropipette Puller Narishige PP-83
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References

  1. Nishimura, N., Schaffer, C. B., Friedman, B., Lyden, P. D., Kleinfeld, D. Penetrating arterioles are a bottleneck in the perfusion of neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (1), 365-370 (2007).
  2. Shih, A. Y., et al. Robust and fragile aspects of cortical blood flow in relation to the underlying angioarchitecture. Microcirculation (New York, N.Y.:1994). 22 (3), 204-218 (2015).
  3. Cipolla, M. J., Smith, J., Kohlmeyer, M. M., Godfrey, J. A. SKCa and IKCa Channels, Myogenic Tone, and Vasodilator Responses in Middle Cerebral Arteries and Parenchymal Arterioles: Effect of Ischemia and Reperfusion. Stroke. 40 (4), 1451-1457 (2009).
  4. Nystoriak, M. A., et al. Fundamental increase in pressure-dependent constriction of brain parenchymal arterioles from subarachnoid hemorrhage model rats due to membrane depolarization. AJP: Heart and Circulatory Physiology. 300 (3), H803-H812 (2011).
  5. Dabertrand, F., Nelson, M. T., Brayden, J. E. Acidosis dilates brain parenchymal arterioles by conversion of calcium waves to sparks to activate BK channels. Circulation Research. 110 (2), 285-294 (2012).
  6. Dabertrand, F., Nelson, M. T., Brayden, J. E. Ryanodine receptors, calcium signaling, and regulation of vascular tone in the cerebral parenchymal microcirculation. Microcirculation (New York, N.Y.:1994). 20 (4), 307-316 (2013).
  7. Cipolla, M. J., et al. Increased pressure-induced tone in rat parenchymal arterioles vs. middle cerebral arteries: role of ion channels and calcium sensitivity. Journal of Applied Physiology. 117 (1), 53-59 (2014).
  8. De Silva, T. M., Modrick, M. L., Dabertrand, F., Faraci, F. M. Changes in Cerebral Arteries and Parenchymal Arterioles with Aging: Role of Rho Kinase 2 and Impact of Genetic Background. Hypertension. 71 (5), 921-927 (2018).
  9. Shih, A. Y., et al. The smallest stroke: occlusion of one penetrating vessel leads to infarction and a cognitive deficit. Nature Neuroscience. 16 (1), 55-63 (2013).
  10. Koide, M., et al. The yin and yang of KV channels in cerebral small vessel pathologies. Microcirculation (New York, N.Y.:1994). 25 (1), (2018).
  11. Girouard, H., et al. Astrocytic endfoot Ca2+ and BK channels determine both arteriolar dilation and constriction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3811-3816 (2010).
  12. Dabertrand, F., et al. Prostaglandin E2, a postulated astrocyte-derived neurovascular coupling agent, constricts rather than dilates parenchymal arterioles. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 33 (4), 479-482 (2013).
  13. Longden, T. A., Dabertrand, F., Hill-Eubanks, D. C., Hammack, S. E., Nelson, M. T. Stress-induced glucocorticoid signaling remodels neurovascular coupling through impairment of cerebrovascular inwardly rectifying K+ channel function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (20), 7462-7467 (2014).
  14. Dabertrand, F., et al. Potassium channelopathy-like defect underlies early-stage cerebrovascular dysfunction in a genetic model of small vessel disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (7), E796-E805 (2015).
  15. Pires, P. W., Sullivan, M. N., Pritchard, H. A. T., Robinson, J. J., Earley, S. Unitary TRPV3 channel Ca2+ influx events elicit endothelium-dependent dilation of cerebral parenchymal arterioles. AJP: Heart and Circulatory Physiology. 309 (12), H2031-H2041 (2015).
  16. Johnson, A. C., Cipolla, M. J. Altered hippocampal arteriole structure and function in a rat model of preeclampsia: Potential role in impaired seizure-induced hyperemia. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 37 (8), 2857-2869 (2016).
  17. Johnson, A. C., Miller, J. E., Cipolla, M. J. Memory impairment in spontaneously hypertensive rats is associated with hippocampal hypoperfusion and hippocampal vascular dysfunction. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. , (2019).
  18. Iadecola, C. The Neurovascular Unit Coming of Age: A Journey through Neurovascular Coupling in Health and Disease. Neuron. 96 (1), 17-42 (2017).
  19. Roy, C. S., Sherrington, C. S. On the Regulation of the Blood-supply of the Brain. The Journal of Physiology. 11 (1-2), 85-158 (1890).
  20. Longden, T. A., et al. Capillary K+-sensing initiates retrograde hyperpolarization to increase local cerebral blood flow. Nature Neuroscience. 20 (5), 717-726 (2017).
  21. Harraz, O. F., Longden, T. A., Dabertrand, F., Hill-Eubanks, D., Nelson, M. T. Endothelial GqPCR activity controls capillary electrical signaling and brain blood flow through PIP2 depletion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (15), E3569-E3577 (2018).
  22. Harraz, O. F., Longden, T. A., Hill-Eubanks, D., Nelson, M. T. PIP2 depletion promotes TRPV4 channel activity in mouse brain capillary endothelial cells. eLife. 7, 351 (2018).
  23. Hodgkin, A. L., Huxley, A. F. A quantitative description of membrane current and its application to conduction and excitation in nerve. The Journal of Physiology. 117 (4), 500-544 (1952).
  24. Ballanyi, K., Doutheil, J., Brockhaus, J. Membrane potentials and microenvironment of rat dorsal vagal cells in vitro during energy depletion. The Journal of Physiology. 495 (Pt 3), 769-784 (1996).
  25. Filosa, J. A., et al. Local potassium signaling couples neuronal activity to vasodilation in the brain. Nature Neuroscience. 9 (11), 1397-1403 (2006).
  26. Attwell, D., et al. Glial and neuronal control of brain blood flow. Nature. 468 (7321), 232-243 (2010).
  27. Coyle, P. Vascular patterns of the rat hippocampal formation. Experimental Neurology. 52 (3), 447-458 (1976).
  28. Wang, H. R., et al. Selective inhibition of the K(ir)2 family of inward rectifier potassium channels by a small molecule probe: the discovery, SAR, and pharmacological characterization of ML133. ACS Chemical Biology. 6 (8), 845-856 (2011).
  29. Pires, P. W., Dabertrand, F., Earley, S. Isolation and Cannulation of Cerebral Parenchymal Arterioles. Journal of Visualized Experiments. (111), 1-11 (2016).
  30. Bayliss, W. M. On the local reactions of the arterial wall to changes of internal pressure. The Journal of Physiology. 28 (3), 220-231 (1902).
  31. Montagne, A., et al. Blood-brain barrier breakdown in the aging human hippocampus. Neuron. 85 (2), 296-302 (2015).
  32. Zhang, X., et al. Circulating heparin oligosaccharides rapidly target the hippocampus in sepsis, potentially impacting cognitive functions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (19), 9208-9213 (2019).
  33. Kim, K. J., Filosa, J. A. Advanced in vitro approach to study neurovascular coupling mechanisms in the brain microcirculation. The Journal of Physiology. 590 (7), 1757-1770 (2012).

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Rosehart, A. C., Johnson, A. C., Dabertrand, F. Ex Vivo Pressurized Hippocampal Capillary-Parenchymal Arteriole Preparation for Functional Study. J. Vis. Exp. (154), e60676, doi:10.3791/60676 (2019).
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