Ex Vivo Под давлением Гиппокампального Капилляры-Паранчимал Артериол Подготовка для функционального исследования
Summary
В настоящей рукописи подробно описано, как изолировать гиппокампа артериолы и капилляры из мозга мыши и как надавить на них для давления myography, иммунофлюоресценции, биохимии и молекулярных исследований.
Abstract
От тонких поведенческих изменений до поздней стадии деменции, сосудистые когнитивные нарушения обычно развивается после ишемии головного мозга. Инсульт и остановка сердца удивительно сексуально диморфных заболеваний, и оба вызывают ишемию головного мозга. Тем не менее, прогресс в понимании сосудистых когнитивных нарушений, а затем разработки секс-специфических методов лечения, была частично ограничена проблемами в исследовании микроциркуляции мозга из моделей мыши в функциональных исследованиях. Здесь мы представляем подход к изучению капилляров к артериолу сигнализации в ex vivo гиппокампа капилляра-паранхимального артериола (HiCaPA) препарат из мозга мыши. Мы описываем, как изолировать, кануляции и давления микроциркуляции для измерения диаметра артериоляров в ответ на стимуляцию капилляров. Мы показываем, какие соответствующие функциональные элементы управления могут быть использованы для проверки целостности подготовки HiCaPA и отображения типичных результатов, в том числе тестирование калия в качестве нервно-сосудистого связующего агента и эффект недавно характеризуется ингибитор Kir2 внутренне выправила калий канала семьи, ML133. Кроме того, мы сравниваем ответы в препаратах, полученных от мышей мужского и женского пола. Хотя эти данные отражают функциональные исследования, наш подход также может быть использован в молекулярной биологии, иммунохимии и электрофизиологии исследований.
Introduction
Pial циркуляции на поверхности мозга был объектом много исследований, отчасти из-за его экспериментальной доступности. Однако топология сосуды головного мозга создает отдельные регионы. В отличие от надежной пиальной сети, богатой анастомосами со значительной способностью перенаправлять кровоток, внутримозговые паренхимальные артериолы (ПА) представляют ограниченное обеспечение, каждый из которых пронизывает дискретный объем нервной ткани1,2. Это создает узкое место влияние на кровоток, который, в сочетании с уникальными физиологическими особенностями3,4,5,6,7,8, делает внутримозговые артериолы важным местом для мозгового кровотока (CBF) регулирование9,10. Несмотря на технические проблемы, присущие изоляции и канистра ПА, в последнее десятилетие наблюдается повышенный интерес к ex vivo функциональных исследований с использованием под давлением судов11,12,13,14,15,16,17. Одной из причин такого повышенного интереса является значительный исследовательский опыт, проведенный на нервно-сосудистых сцепления (NVC), механизм поддержания мозга функциональной гиперемии18.
На региональном уровне, CBF может быстро увеличиться после локальной нейроннойактивации 19. Сотовые механизмы и сигнальные свойства, контролирующие NVC, не полностью понятны. Тем не менее, мы определили ранее непредвиденную роль для капилляров мозга во время NVC в зондировании нейронной активности и переводе его в гиперполяризующий электрический сигнал, чтобы расшифывать вверх по течению артериолы20,21,22. Потенциалы действий23,24 и открытие крупнопроводимого Ca 2-активированныхканалов K(BK) на астроцитарных эндфутах25,26 увеличивают интерстициальную концентрацию иона калия, что приводит к активации сильного внутреннего выпрямителя K(Кир) каналов в сосудистом эндотелии капилляров. Этот канал активируется внешнимK, но и самой гиперполяризации. Распространение через разрыв узлов, гиперполяризующий ток затем регенерирует в соседних капиллярных эндотелиальных клеток до артериола, где он вызывает релаксацию миоцитов и CBF увеличение20,21. Изучение этого механизма привело нас к разработке под давлением капиллярно-паранхимального артериола (CaPA) для измерения диаметра артериоляров во время стимуляции капилляров с помощью вазоактивных агентов. Препарат CaPA состоит из консервированного внутримозгового артериола сегмента с нетронутыми, вниз по течению капиллярных последствий. Концы капилляров сжимаются на дно камерного стекла микропипеттом, который окклюзии и стабилизирует все сосудистое образование20,21.
Ранее мы сделали инструментальные инновации, изображая препараты CaPA из коры мыши20,21 и артериол от крыс миндалины13 и гиппокампа16,17. Поскольку гиппокампа сосуды получает больше внимания из-за его восприимчивости к патологическим условиям, здесь мы предоставляем пошаговый метод для подготовки КаПА из мыши гиппокампа (HiCaPA), который может быть использован не только в функциональных исследованиях NVC, но и в молекулярной биологии, иммунохимии и электрофизиологии.
Protocol
Representative Results
Discussion
Препарат HiCaPA под давлением HiCaPA (гиппокампа капиллярно-паранхимального артериола), описанный в настоящей рукописи, является продолжением нашей устоявшейся процедуры изоляции, давления и изучения паренхимальных артериол29. Недавно мы сообщили, что Kir2.1 каналов в мозге капил?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить Джулс Морин за глубокие комментарии к рукописи. Это исследование было профинансировано наградами от некоммерческой организации CADASIL Together We Have Hope, Центра здоровья и исследований женщин и NHLBI R01HL136636 (FD).
Materials
| 0.22µm Syringe Filters | CELLTREAT Scientific Products | 229751 | |
| 12-0 Nylon (12cm) Black | Microsurgery Instruments, Inc | S12-0 NYLON | |
| Automatic Temperature Controller | Warner Instruments | TC-324B | |
| Borosilicate Glass O.D.: 1.2 mm, I.D.: 0.68 mm | Sutter Instruments | B120-69-10 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| CaCl2 dihydrate | Sigma-Aldrich | C3881 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| Dissection Scope | Olympus | SZ11 | |
| ECOLINE VC-MS/CA 4-12 — complete Pump with Drive and MS/CA 4-12 pump-head | Ismatec | ISM 1090 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| Fine Scissors – Sharp | Fine Science Tools | 14063-09 | |
| Inline Water Heater | Warner Instruments | SH-27B | |
| Integra™ Miltex™Tissue Forceps | Fisher Scientific | 12-460-117 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5379 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | M1880 | |
| MgCl Anhydrous | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Micromanipulator | Narishige | MN-153 | |
| ML 133 hydrochloride | Tocris | 4549 | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9625 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S8875 | |
| NS309 | Tocris | 3895 | |
| Picospritzer III – Intracellular Microinjection Dispense Systems, 2-channel | Parker Hannifin | 052-0500-900 | |
| Pressure Servo Controller with Peristaltic Pump | Living Systems Instrumentation | PS-200 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P3662 | |
| Super Fine Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Surgical Scissors – Sharp-Blunt | Fine Science Tools | 14001-13 | |
| Vertical Micropipette Puller | Narishige | PP-83 |
References
- Nishimura, N., Schaffer, C. B., Friedman, B., Lyden, P. D., Kleinfeld, D. Penetrating arterioles are a bottleneck in the perfusion of neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (1), 365-370 (2007).
- Shih, A. Y., et al. Robust and fragile aspects of cortical blood flow in relation to the underlying angioarchitecture. Microcirculation (New York, N.Y.:1994). 22 (3), 204-218 (2015).
- Cipolla, M. J., Smith, J., Kohlmeyer, M. M., Godfrey, J. A. SKCa and IKCa Channels, Myogenic Tone, and Vasodilator Responses in Middle Cerebral Arteries and Parenchymal Arterioles: Effect of Ischemia and Reperfusion. Stroke. 40 (4), 1451-1457 (2009).
- Nystoriak, M. A., et al. Fundamental increase in pressure-dependent constriction of brain parenchymal arterioles from subarachnoid hemorrhage model rats due to membrane depolarization. AJP: Heart and Circulatory Physiology. 300 (3), H803-H812 (2011).
- Dabertrand, F., Nelson, M. T., Brayden, J. E. Acidosis dilates brain parenchymal arterioles by conversion of calcium waves to sparks to activate BK channels. Circulation Research. 110 (2), 285-294 (2012).
- Dabertrand, F., Nelson, M. T., Brayden, J. E. Ryanodine receptors, calcium signaling, and regulation of vascular tone in the cerebral parenchymal microcirculation. Microcirculation (New York, N.Y.:1994). 20 (4), 307-316 (2013).
- Cipolla, M. J., et al. Increased pressure-induced tone in rat parenchymal arterioles vs. middle cerebral arteries: role of ion channels and calcium sensitivity. Journal of Applied Physiology. 117 (1), 53-59 (2014).
- De Silva, T. M., Modrick, M. L., Dabertrand, F., Faraci, F. M. Changes in Cerebral Arteries and Parenchymal Arterioles with Aging: Role of Rho Kinase 2 and Impact of Genetic Background. Hypertension. 71 (5), 921-927 (2018).
- Shih, A. Y., et al. The smallest stroke: occlusion of one penetrating vessel leads to infarction and a cognitive deficit. Nature Neuroscience. 16 (1), 55-63 (2013).
- Koide, M., et al. The yin and yang of KV channels in cerebral small vessel pathologies. Microcirculation (New York, N.Y.:1994). 25 (1), (2018).
- Girouard, H., et al. Astrocytic endfoot Ca2+ and BK channels determine both arteriolar dilation and constriction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3811-3816 (2010).
- Dabertrand, F., et al. Prostaglandin E2, a postulated astrocyte-derived neurovascular coupling agent, constricts rather than dilates parenchymal arterioles. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 33 (4), 479-482 (2013).
- Longden, T. A., Dabertrand, F., Hill-Eubanks, D. C., Hammack, S. E., Nelson, M. T. Stress-induced glucocorticoid signaling remodels neurovascular coupling through impairment of cerebrovascular inwardly rectifying K+ channel function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (20), 7462-7467 (2014).
- Dabertrand, F., et al. Potassium channelopathy-like defect underlies early-stage cerebrovascular dysfunction in a genetic model of small vessel disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (7), E796-E805 (2015).
- Pires, P. W., Sullivan, M. N., Pritchard, H. A. T., Robinson, J. J., Earley, S. Unitary TRPV3 channel Ca2+ influx events elicit endothelium-dependent dilation of cerebral parenchymal arterioles. AJP: Heart and Circulatory Physiology. 309 (12), H2031-H2041 (2015).
- Johnson, A. C., Cipolla, M. J. Altered hippocampal arteriole structure and function in a rat model of preeclampsia: Potential role in impaired seizure-induced hyperemia. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 37 (8), 2857-2869 (2016).
- Johnson, A. C., Miller, J. E., Cipolla, M. J. Memory impairment in spontaneously hypertensive rats is associated with hippocampal hypoperfusion and hippocampal vascular dysfunction. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. , (2019).
- Iadecola, C. The Neurovascular Unit Coming of Age: A Journey through Neurovascular Coupling in Health and Disease. Neuron. 96 (1), 17-42 (2017).
- Roy, C. S., Sherrington, C. S. On the Regulation of the Blood-supply of the Brain. The Journal of Physiology. 11 (1-2), 85-158 (1890).
- Longden, T. A., et al. Capillary K+-sensing initiates retrograde hyperpolarization to increase local cerebral blood flow. Nature Neuroscience. 20 (5), 717-726 (2017).
- Harraz, O. F., Longden, T. A., Dabertrand, F., Hill-Eubanks, D., Nelson, M. T. Endothelial GqPCR activity controls capillary electrical signaling and brain blood flow through PIP2 depletion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (15), E3569-E3577 (2018).
- Harraz, O. F., Longden, T. A., Hill-Eubanks, D., Nelson, M. T. PIP2 depletion promotes TRPV4 channel activity in mouse brain capillary endothelial cells. eLife. 7, 351 (2018).
- Hodgkin, A. L., Huxley, A. F. A quantitative description of membrane current and its application to conduction and excitation in nerve. The Journal of Physiology. 117 (4), 500-544 (1952).
- Ballanyi, K., Doutheil, J., Brockhaus, J. Membrane potentials and microenvironment of rat dorsal vagal cells in vitro during energy depletion. The Journal of Physiology. 495 (Pt 3), 769-784 (1996).
- Filosa, J. A., et al. Local potassium signaling couples neuronal activity to vasodilation in the brain. Nature Neuroscience. 9 (11), 1397-1403 (2006).
- Attwell, D., et al. Glial and neuronal control of brain blood flow. Nature. 468 (7321), 232-243 (2010).
- Coyle, P. Vascular patterns of the rat hippocampal formation. Experimental Neurology. 52 (3), 447-458 (1976).
- Wang, H. R., et al. Selective inhibition of the K(ir)2 family of inward rectifier potassium channels by a small molecule probe: the discovery, SAR, and pharmacological characterization of ML133. ACS Chemical Biology. 6 (8), 845-856 (2011).
- Pires, P. W., Dabertrand, F., Earley, S. Isolation and Cannulation of Cerebral Parenchymal Arterioles. Journal of Visualized Experiments. (111), 1-11 (2016).
- Bayliss, W. M. On the local reactions of the arterial wall to changes of internal pressure. The Journal of Physiology. 28 (3), 220-231 (1902).
- Montagne, A., et al. Blood-brain barrier breakdown in the aging human hippocampus. Neuron. 85 (2), 296-302 (2015).
- Zhang, X., et al. Circulating heparin oligosaccharides rapidly target the hippocampus in sepsis, potentially impacting cognitive functions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (19), 9208-9213 (2019).
- Kim, K. J., Filosa, J. A. Advanced in vitro approach to study neurovascular coupling mechanisms in the brain microcirculation. The Journal of Physiology. 590 (7), 1757-1770 (2012).
