Ex vivo trycksatt Hippocampus kapillär-parenkymal arteriole förberedelse för funktionell studie
Summary
Den nuvarande manuskript Detaljer hur man isolerar Hippocampus arterioler och kapillärer från mus hjärnan och hur man pressar dem för tryck myography, immunofluorescenser, biokemi, och molekylära studier.
Abstract
Från subtila beteendemässiga förändringar till sent stadium demens, vaskulär kognitiv svikt utvecklas typiskt efter cerebral ischit. Stroke och hjärtstillestånd är anmärkningsvärt sexuellt dimorfiska sjukdomar, och båda inducera cerebral ischa. Emellertid, framsteg i förståelsen av vaskulär kognitiv svikt, och sedan utveckla könsspecifika behandlingar, har delvis begränsats av utmaningar i att undersöka hjärnans mikrocirkulation från musmodeller i funktionella studier. Här presenterar vi en metod för att undersöka kapillär-till-arteriole signalering i en ex vivo Hippocampus kapillär-parenkymal arteriole (HiCaPA) beredning från mushjärna. Vi beskriver hur man isolerar, kanylera, och pressa mikrocirkulationen för att mäta arteriolär diameter som svar på kapillärstimulering. Vi visar vilka lämpliga funktionella kontroller kan användas för att validera HiCaPA förberedelse integritet och Visa typiska resultat, inklusive testning av kalium som en neurovaskulär koppling agent och effekten av den nyligen kännetecknas hämmare av Kir2 inåt korrigera kalium kanal familj, ML133. Vidare jämför vi svaren i beredningar erhållna från manliga och kvinnliga möss. Även om dessa data återspeglar funktionella utredningar, kan vår metod också användas inom molekylärbiologi, immunokemi och elektrofysiologiska studier.
Introduction
Den piala cirkulationen på hjärnans yta har varit föremål för mycket studie, delvis på grund av dess experimentella tillgänglighet. Dock skapar topologin för cerebral kärlsystemet distinkta regioner. I motsats till den robusta Arvika nätverk rik på anastomoser med betydande kapacitet för att omdirigera blodflödet, intracerebral parenkymala arterioler (PAS) nuvarande begränsade säkerheter försörjning, var och en av dem parfymera en diskret volym av nervvävnad1,2. Detta skapar en flaskhals effekt på blodflödet som, kombinerat med unika fysiologiska funktioner3,4,5,6,7,8, gör intracerebral arterioler en avgörande plats för cerebralt blodflöde (CBF)regel 9,10. Trots de tekniska utmaningarna i samband med isolering och kanylering av utbetalande organen har det senaste decenniet sett ett ökat intresse för ex vivo funktionella studier med tryckkärl11,12,13,14,15,16,17. En av anledningarna till detta ökade intresse är den avsevärda forskningsinsatser som bedrivs på neurovaskulär koppling (NVC), mekanismen upprätthålla hjärnans funktionella hyperemi18.
Regionalt, CBF kan snabbt öka efter lokala neurala aktiveringen19. Den cellulära mekanismer och signalering egenskaper kontrollera NVC är ofullständigt förstås. Emellertid, vi identifierade en tidigare oväntad roll för hjärnans kapillärer under NVC i avkänning Neural aktivitet och översätta den till en hyperpolariserande elektrisk signal till vidga uppströms arterioler20,21,22. Actionpotentialer23,24 och öppnande av stor-conductance ca2 +-aktiverad K+ (BK) kanaler på astrocytic endfeet25,26 öka interstitiell kalium Jon koncentrationen [k+]o, vilket resulterar i aktivering av stark aktiv likriktare K+ (KIR) kanaler i det vaskulära endotelet i kapillärerna. Denna kanal aktiveras av externa K+ men också av hyperpolarisering själv. Spridning genom gap korsningar, den hyperpolariserande strömmen sedan återskapar i angränsande kapillära endotelceller upp till arteriole, där det orsakar myocyt avslappning och CBF öka20,21. Studiet av denna mekanism ledde oss att utveckla en trycksatt kapillär-parenkymal arteriole (Capa) beredning för att mäta arteriolär diametern under kapillärstimulering med vasoaktiva agenter. Den CaPA preparatet består av en kanylerad intracerebral arteriole segment med en intakt, nedströms kapillär ramification. Kapillärändarna komprimeras mot kammarens glasbotten med en mikropipett, som ockluderar och stabiliserar hela vaskulär bildningen20,21.
Vi har tidigare gjort instrumentella innovationer genom Imaging Capa preparat från mus barken20,21 och arterioler från råtta amygdala13 och Hippocampus16,17. Som Hippocampus kärlsystemet får mer uppmärksamhet på grund av dess mottaglighet för patologiska tillstånd, här ger vi en steg-för-steg-metod för Capa beredning från musen Hippocampus (hicapa) som inte bara kan användas i funktionella NVC studier men också i molekylärbiologi, immunokemi, och elektrofysiologi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den trycksatta hicapa (Hippocampus kapillär-parenkymal arteriole) beredning beskrivs i det nuvarande manuskriptet är en förlängning av vår väletablerade förfarande för att isolera, tryck, och studera parenkymal arterioler29. Vi rapporterade nyligen att Kir 2,1 kanaler i hjärnan kapillära endotelceller känsla ökar i [K+]o i samband med neurala aktivering, och generera en stigande hyperpolariserande signal som Vidar uppströms arterioler20. A…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna skulle vilja tacka Jules Morin för insiktsfulla kommentarer på manuskriptet. Denna forskning finansierades av utmärkelser från CADASIL tillsammans har vi hopp ideell organisation, centrum för kvinnors hälsa och forskning, och NHLBI R01HL136636 (FD).
Materials
| 0.22µm Syringe Filters | CELLTREAT Scientific Products | 229751 | |
| 12-0 Nylon (12cm) Black | Microsurgery Instruments, Inc | S12-0 NYLON | |
| Automatic Temperature Controller | Warner Instruments | TC-324B | |
| Borosilicate Glass O.D.: 1.2 mm, I.D.: 0.68 mm | Sutter Instruments | B120-69-10 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| CaCl2 dihydrate | Sigma-Aldrich | C3881 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| Dissection Scope | Olympus | SZ11 | |
| ECOLINE VC-MS/CA 4-12 — complete Pump with Drive and MS/CA 4-12 pump-head | Ismatec | ISM 1090 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| Fine Scissors – Sharp | Fine Science Tools | 14063-09 | |
| Inline Water Heater | Warner Instruments | SH-27B | |
| Integra™ Miltex™Tissue Forceps | Fisher Scientific | 12-460-117 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5379 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | M1880 | |
| MgCl Anhydrous | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Micromanipulator | Narishige | MN-153 | |
| ML 133 hydrochloride | Tocris | 4549 | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9625 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S8875 | |
| NS309 | Tocris | 3895 | |
| Picospritzer III – Intracellular Microinjection Dispense Systems, 2-channel | Parker Hannifin | 052-0500-900 | |
| Pressure Servo Controller with Peristaltic Pump | Living Systems Instrumentation | PS-200 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P3662 | |
| Super Fine Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Surgical Scissors – Sharp-Blunt | Fine Science Tools | 14001-13 | |
| Vertical Micropipette Puller | Narishige | PP-83 |
References
- Nishimura, N., Schaffer, C. B., Friedman, B., Lyden, P. D., Kleinfeld, D. Penetrating arterioles are a bottleneck in the perfusion of neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (1), 365-370 (2007).
- Shih, A. Y., et al. Robust and fragile aspects of cortical blood flow in relation to the underlying angioarchitecture. Microcirculation (New York, N.Y.:1994). 22 (3), 204-218 (2015).
- Cipolla, M. J., Smith, J., Kohlmeyer, M. M., Godfrey, J. A. SKCa and IKCa Channels, Myogenic Tone, and Vasodilator Responses in Middle Cerebral Arteries and Parenchymal Arterioles: Effect of Ischemia and Reperfusion. Stroke. 40 (4), 1451-1457 (2009).
- Nystoriak, M. A., et al. Fundamental increase in pressure-dependent constriction of brain parenchymal arterioles from subarachnoid hemorrhage model rats due to membrane depolarization. AJP: Heart and Circulatory Physiology. 300 (3), H803-H812 (2011).
- Dabertrand, F., Nelson, M. T., Brayden, J. E. Acidosis dilates brain parenchymal arterioles by conversion of calcium waves to sparks to activate BK channels. Circulation Research. 110 (2), 285-294 (2012).
- Dabertrand, F., Nelson, M. T., Brayden, J. E. Ryanodine receptors, calcium signaling, and regulation of vascular tone in the cerebral parenchymal microcirculation. Microcirculation (New York, N.Y.:1994). 20 (4), 307-316 (2013).
- Cipolla, M. J., et al. Increased pressure-induced tone in rat parenchymal arterioles vs. middle cerebral arteries: role of ion channels and calcium sensitivity. Journal of Applied Physiology. 117 (1), 53-59 (2014).
- De Silva, T. M., Modrick, M. L., Dabertrand, F., Faraci, F. M. Changes in Cerebral Arteries and Parenchymal Arterioles with Aging: Role of Rho Kinase 2 and Impact of Genetic Background. Hypertension. 71 (5), 921-927 (2018).
- Shih, A. Y., et al. The smallest stroke: occlusion of one penetrating vessel leads to infarction and a cognitive deficit. Nature Neuroscience. 16 (1), 55-63 (2013).
- Koide, M., et al. The yin and yang of KV channels in cerebral small vessel pathologies. Microcirculation (New York, N.Y.:1994). 25 (1), (2018).
- Girouard, H., et al. Astrocytic endfoot Ca2+ and BK channels determine both arteriolar dilation and constriction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3811-3816 (2010).
- Dabertrand, F., et al. Prostaglandin E2, a postulated astrocyte-derived neurovascular coupling agent, constricts rather than dilates parenchymal arterioles. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 33 (4), 479-482 (2013).
- Longden, T. A., Dabertrand, F., Hill-Eubanks, D. C., Hammack, S. E., Nelson, M. T. Stress-induced glucocorticoid signaling remodels neurovascular coupling through impairment of cerebrovascular inwardly rectifying K+ channel function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (20), 7462-7467 (2014).
- Dabertrand, F., et al. Potassium channelopathy-like defect underlies early-stage cerebrovascular dysfunction in a genetic model of small vessel disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (7), E796-E805 (2015).
- Pires, P. W., Sullivan, M. N., Pritchard, H. A. T., Robinson, J. J., Earley, S. Unitary TRPV3 channel Ca2+ influx events elicit endothelium-dependent dilation of cerebral parenchymal arterioles. AJP: Heart and Circulatory Physiology. 309 (12), H2031-H2041 (2015).
- Johnson, A. C., Cipolla, M. J. Altered hippocampal arteriole structure and function in a rat model of preeclampsia: Potential role in impaired seizure-induced hyperemia. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 37 (8), 2857-2869 (2016).
- Johnson, A. C., Miller, J. E., Cipolla, M. J. Memory impairment in spontaneously hypertensive rats is associated with hippocampal hypoperfusion and hippocampal vascular dysfunction. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. , (2019).
- Iadecola, C. The Neurovascular Unit Coming of Age: A Journey through Neurovascular Coupling in Health and Disease. Neuron. 96 (1), 17-42 (2017).
- Roy, C. S., Sherrington, C. S. On the Regulation of the Blood-supply of the Brain. The Journal of Physiology. 11 (1-2), 85-158 (1890).
- Longden, T. A., et al. Capillary K+-sensing initiates retrograde hyperpolarization to increase local cerebral blood flow. Nature Neuroscience. 20 (5), 717-726 (2017).
- Harraz, O. F., Longden, T. A., Dabertrand, F., Hill-Eubanks, D., Nelson, M. T. Endothelial GqPCR activity controls capillary electrical signaling and brain blood flow through PIP2 depletion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (15), E3569-E3577 (2018).
- Harraz, O. F., Longden, T. A., Hill-Eubanks, D., Nelson, M. T. PIP2 depletion promotes TRPV4 channel activity in mouse brain capillary endothelial cells. eLife. 7, 351 (2018).
- Hodgkin, A. L., Huxley, A. F. A quantitative description of membrane current and its application to conduction and excitation in nerve. The Journal of Physiology. 117 (4), 500-544 (1952).
- Ballanyi, K., Doutheil, J., Brockhaus, J. Membrane potentials and microenvironment of rat dorsal vagal cells in vitro during energy depletion. The Journal of Physiology. 495 (Pt 3), 769-784 (1996).
- Filosa, J. A., et al. Local potassium signaling couples neuronal activity to vasodilation in the brain. Nature Neuroscience. 9 (11), 1397-1403 (2006).
- Attwell, D., et al. Glial and neuronal control of brain blood flow. Nature. 468 (7321), 232-243 (2010).
- Coyle, P. Vascular patterns of the rat hippocampal formation. Experimental Neurology. 52 (3), 447-458 (1976).
- Wang, H. R., et al. Selective inhibition of the K(ir)2 family of inward rectifier potassium channels by a small molecule probe: the discovery, SAR, and pharmacological characterization of ML133. ACS Chemical Biology. 6 (8), 845-856 (2011).
- Pires, P. W., Dabertrand, F., Earley, S. Isolation and Cannulation of Cerebral Parenchymal Arterioles. Journal of Visualized Experiments. (111), 1-11 (2016).
- Bayliss, W. M. On the local reactions of the arterial wall to changes of internal pressure. The Journal of Physiology. 28 (3), 220-231 (1902).
- Montagne, A., et al. Blood-brain barrier breakdown in the aging human hippocampus. Neuron. 85 (2), 296-302 (2015).
- Zhang, X., et al. Circulating heparin oligosaccharides rapidly target the hippocampus in sepsis, potentially impacting cognitive functions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (19), 9208-9213 (2019).
- Kim, K. J., Filosa, J. A. Advanced in vitro approach to study neurovascular coupling mechanisms in the brain microcirculation. The Journal of Physiology. 590 (7), 1757-1770 (2012).
