Ex vivo trykk hippocampus kapillær-Parenkymatøs Arteriole forberedelse for funksjonell studie
Summary
Den nåværende manuskriptet detaljer hvordan å isolere hippocampus arterioler og blodkar fra musen hjernen og hvordan å pressurize dem for press myography, immunofluorescence, biokjemi, og molekylær studier.
Abstract
Fra subtile atferdsendringer til sen-stadiet demens, vaskulær kognitiv svekkelse vanligvis utvikler følgende cerebral iskemi. Hjerneslag og hjertestans er bemerkelsesverdig seksuelt dimorphic sykdommer, og begge induserer cerebral iskemi. Men fremgang i forståelsen av vaskulær kognitiv svekkelse, og deretter utvikle sex-spesifikke behandlinger, har vært delvis begrenset av utfordringer i å undersøke hjernen mikrosirkulasjonen fra musemodeller i funksjonelle studier. Her presenterer vi en tilnærming for å undersøke kapillær-til-arteriole signalering i en ex vivo hippocampus kapillær-parenkymatøs Arteriole (HiCaPA) forberedelse fra mus hjernen. Vi beskriver hvordan du isolerer, kannelerer og pressurize mikrosirkulasjonen for å måle arterioler diameter som respons på kapillær stimulering. Vi viser hvilke egnede funksjonelle kontroller kan brukes til å validere HiCaPA forberedelse integritet og vise typiske resultater, inkludert testing kalium som en nevrovaskulære kopling agent og effekten av den nylig karakterisert hemmer av Kir2 innover rectifying kalium kanal familien, ML133. Videre sammenligner vi svarene i forberedelsene innhentet fra mannlige og kvinnelige mus. Selv om disse dataene reflekterer funksjonelle undersøkelser, kan tilnærmingen vår også brukes i molekylærbiologi, immunokjemi og elektrofysiologi studier.
Introduction
Den saify sirkulasjon på overflaten av hjernen har vært gjenstand for mye studier, dels på grunn av sin eksperimentelle tilgjengelighet. Topologien i cerebral blodkar skaper imidlertid atskilte områder. I motsetning til den robuste saify nettverk rik på anastomoser med betydelig kapasitet for å omdirigere blodstrømmen, den intracerebrale parenkymatøs arterioler (Pas) presentere begrenset sikkerhet forsyning, hver av dem perfusing en diskret volum av nervøse vev1,2. Dette skaper en flaskehals effekt på blodstrømmen som, kombinert med unike fysiologiske funksjoner3,4,5,6,7,8, gjør intracerebrale arterioler et avgjørende sted for cerebral blodstrøm (CBF) regulering9,10. Til tross for de tekniske utfordringene som ligger i isolasjon og kanyleringen av Pas, har det siste tiåret sett en økt interesse for ex vivo funksjons studier som bruker trykkbeholdere11,12,13,14,15,16,17. En av grunnene til denne økte interessen er betydelig forskningsinnsats utført på nevrovaskulære kopling (NVC), mekanismen opprettholde hjernen funksjonell hyperemia18.
Regionalt kan CBF raskt øke følgende lokale nevrale aktivisering19. Den cellulære mekanismer og signalering egenskaper kontrollerende NVC er ufullstendig forstått. Men vi identifiserte en tidligere uforutsett rolle for hjernen blodkar under NVC i sensing neural aktivitet og oversette den til en hyperpolarizing elektrisk signal til dilate oppstrøms arterioler20,21,22. Action potensialer23,24 og åpning av store konduktans ca2 +-aktivert K+ (BK) kanaler på astrocytic endfeet25,26 øke interstitiell kalium ion konsentrasjon [K+]o, som resulterer i aktivering av sterke innover likeretter K+ (KIR) kanaler i vaskulær endotelet av blodkar. Denne kanalen er aktivert av eksterne K+ men også av hyperpolarization selv. Sprer seg gjennom gap veikryss, hyperpolarizing strøm deretter regenererer i tilstøtende kapillær endothelial celler opp til arteriole, hvor det fører til myocyte avslapping og CBF øke20,21. Studiet av denne mekanismen førte oss til å utvikle en trykk kapillær-parenkymatøs arteriole (CaPA) forberedelse til å måle arterioler diameter under kapillær stimulering med vasoactive midler. Den CaPA preparatet består av et kanylert intracerebrale arteriole segment med en intakt, nedstrøms kapillær forgreninger. Kapillær endene er komprimert mot kammer glass bunnen av en micropipette, som dualcare og stabiliserer hele vaskulær formasjon20,21.
Vi har tidligere gjort instrumental innovasjoner av Imaging CaPA preparater fra musen cortex20,21 og arterioler fra rotte amygdala13 og hippocampus16,17. Som hippocampus blodkar mottar mer oppmerksomhet på grunn av sin mottakelighet for patologiske tilstander, her gir vi en trinnvis metode for CaPA forberedelse fra musen hippocampus (HiCaPA) som ikke bare kan brukes i funksjonelle NVC studier, men også i molekylærbiologi, immunokjemi, og elektrofysiologi.
Protocol
Representative Results
Discussion
HiCaPA (hippocampus kapillær-parenkymatøs arteriole) som er beskrevet i dagens manuskript, er en forlengelse av vår veletablerte prosedyre for å isolere, pressurize og studere parenkymatøs arterioler29. Vi har nylig rapportert at KIR 2.1 kanaler i hjernen kapillær endothelial celler forstand øker i [K+]o assosiert med nevrale aktivisering, og generere en stigende hyperpolarizing signal som utvider oppstrøms arterioler20. Å avsløre denne tidli…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gjerne takke Jules Morin for innsiktsfulle kommentarer til manuskriptet. Denne forskningen ble finansiert av utmerkelser fra CADASIL sammen vi har Hope non-profit organisasjon, Center for Women ‘ s Health and Research, og NHLBI R01HL136636 (FD).
Materials
| 0.22µm Syringe Filters | CELLTREAT Scientific Products | 229751 | |
| 12-0 Nylon (12cm) Black | Microsurgery Instruments, Inc | S12-0 NYLON | |
| Automatic Temperature Controller | Warner Instruments | TC-324B | |
| Borosilicate Glass O.D.: 1.2 mm, I.D.: 0.68 mm | Sutter Instruments | B120-69-10 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| CaCl2 dihydrate | Sigma-Aldrich | C3881 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| Dissection Scope | Olympus | SZ11 | |
| ECOLINE VC-MS/CA 4-12 — complete Pump with Drive and MS/CA 4-12 pump-head | Ismatec | ISM 1090 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| Fine Scissors – Sharp | Fine Science Tools | 14063-09 | |
| Inline Water Heater | Warner Instruments | SH-27B | |
| Integra™ Miltex™Tissue Forceps | Fisher Scientific | 12-460-117 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5379 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | M1880 | |
| MgCl Anhydrous | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Micromanipulator | Narishige | MN-153 | |
| ML 133 hydrochloride | Tocris | 4549 | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9625 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S8875 | |
| NS309 | Tocris | 3895 | |
| Picospritzer III – Intracellular Microinjection Dispense Systems, 2-channel | Parker Hannifin | 052-0500-900 | |
| Pressure Servo Controller with Peristaltic Pump | Living Systems Instrumentation | PS-200 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P3662 | |
| Super Fine Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Surgical Scissors – Sharp-Blunt | Fine Science Tools | 14001-13 | |
| Vertical Micropipette Puller | Narishige | PP-83 |
References
- Nishimura, N., Schaffer, C. B., Friedman, B., Lyden, P. D., Kleinfeld, D. Penetrating arterioles are a bottleneck in the perfusion of neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (1), 365-370 (2007).
- Shih, A. Y., et al. Robust and fragile aspects of cortical blood flow in relation to the underlying angioarchitecture. Microcirculation (New York, N.Y.:1994). 22 (3), 204-218 (2015).
- Cipolla, M. J., Smith, J., Kohlmeyer, M. M., Godfrey, J. A. SKCa and IKCa Channels, Myogenic Tone, and Vasodilator Responses in Middle Cerebral Arteries and Parenchymal Arterioles: Effect of Ischemia and Reperfusion. Stroke. 40 (4), 1451-1457 (2009).
- Nystoriak, M. A., et al. Fundamental increase in pressure-dependent constriction of brain parenchymal arterioles from subarachnoid hemorrhage model rats due to membrane depolarization. AJP: Heart and Circulatory Physiology. 300 (3), H803-H812 (2011).
- Dabertrand, F., Nelson, M. T., Brayden, J. E. Acidosis dilates brain parenchymal arterioles by conversion of calcium waves to sparks to activate BK channels. Circulation Research. 110 (2), 285-294 (2012).
- Dabertrand, F., Nelson, M. T., Brayden, J. E. Ryanodine receptors, calcium signaling, and regulation of vascular tone in the cerebral parenchymal microcirculation. Microcirculation (New York, N.Y.:1994). 20 (4), 307-316 (2013).
- Cipolla, M. J., et al. Increased pressure-induced tone in rat parenchymal arterioles vs. middle cerebral arteries: role of ion channels and calcium sensitivity. Journal of Applied Physiology. 117 (1), 53-59 (2014).
- De Silva, T. M., Modrick, M. L., Dabertrand, F., Faraci, F. M. Changes in Cerebral Arteries and Parenchymal Arterioles with Aging: Role of Rho Kinase 2 and Impact of Genetic Background. Hypertension. 71 (5), 921-927 (2018).
- Shih, A. Y., et al. The smallest stroke: occlusion of one penetrating vessel leads to infarction and a cognitive deficit. Nature Neuroscience. 16 (1), 55-63 (2013).
- Koide, M., et al. The yin and yang of KV channels in cerebral small vessel pathologies. Microcirculation (New York, N.Y.:1994). 25 (1), (2018).
- Girouard, H., et al. Astrocytic endfoot Ca2+ and BK channels determine both arteriolar dilation and constriction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3811-3816 (2010).
- Dabertrand, F., et al. Prostaglandin E2, a postulated astrocyte-derived neurovascular coupling agent, constricts rather than dilates parenchymal arterioles. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 33 (4), 479-482 (2013).
- Longden, T. A., Dabertrand, F., Hill-Eubanks, D. C., Hammack, S. E., Nelson, M. T. Stress-induced glucocorticoid signaling remodels neurovascular coupling through impairment of cerebrovascular inwardly rectifying K+ channel function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (20), 7462-7467 (2014).
- Dabertrand, F., et al. Potassium channelopathy-like defect underlies early-stage cerebrovascular dysfunction in a genetic model of small vessel disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (7), E796-E805 (2015).
- Pires, P. W., Sullivan, M. N., Pritchard, H. A. T., Robinson, J. J., Earley, S. Unitary TRPV3 channel Ca2+ influx events elicit endothelium-dependent dilation of cerebral parenchymal arterioles. AJP: Heart and Circulatory Physiology. 309 (12), H2031-H2041 (2015).
- Johnson, A. C., Cipolla, M. J. Altered hippocampal arteriole structure and function in a rat model of preeclampsia: Potential role in impaired seizure-induced hyperemia. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 37 (8), 2857-2869 (2016).
- Johnson, A. C., Miller, J. E., Cipolla, M. J. Memory impairment in spontaneously hypertensive rats is associated with hippocampal hypoperfusion and hippocampal vascular dysfunction. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. , (2019).
- Iadecola, C. The Neurovascular Unit Coming of Age: A Journey through Neurovascular Coupling in Health and Disease. Neuron. 96 (1), 17-42 (2017).
- Roy, C. S., Sherrington, C. S. On the Regulation of the Blood-supply of the Brain. The Journal of Physiology. 11 (1-2), 85-158 (1890).
- Longden, T. A., et al. Capillary K+-sensing initiates retrograde hyperpolarization to increase local cerebral blood flow. Nature Neuroscience. 20 (5), 717-726 (2017).
- Harraz, O. F., Longden, T. A., Dabertrand, F., Hill-Eubanks, D., Nelson, M. T. Endothelial GqPCR activity controls capillary electrical signaling and brain blood flow through PIP2 depletion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (15), E3569-E3577 (2018).
- Harraz, O. F., Longden, T. A., Hill-Eubanks, D., Nelson, M. T. PIP2 depletion promotes TRPV4 channel activity in mouse brain capillary endothelial cells. eLife. 7, 351 (2018).
- Hodgkin, A. L., Huxley, A. F. A quantitative description of membrane current and its application to conduction and excitation in nerve. The Journal of Physiology. 117 (4), 500-544 (1952).
- Ballanyi, K., Doutheil, J., Brockhaus, J. Membrane potentials and microenvironment of rat dorsal vagal cells in vitro during energy depletion. The Journal of Physiology. 495 (Pt 3), 769-784 (1996).
- Filosa, J. A., et al. Local potassium signaling couples neuronal activity to vasodilation in the brain. Nature Neuroscience. 9 (11), 1397-1403 (2006).
- Attwell, D., et al. Glial and neuronal control of brain blood flow. Nature. 468 (7321), 232-243 (2010).
- Coyle, P. Vascular patterns of the rat hippocampal formation. Experimental Neurology. 52 (3), 447-458 (1976).
- Wang, H. R., et al. Selective inhibition of the K(ir)2 family of inward rectifier potassium channels by a small molecule probe: the discovery, SAR, and pharmacological characterization of ML133. ACS Chemical Biology. 6 (8), 845-856 (2011).
- Pires, P. W., Dabertrand, F., Earley, S. Isolation and Cannulation of Cerebral Parenchymal Arterioles. Journal of Visualized Experiments. (111), 1-11 (2016).
- Bayliss, W. M. On the local reactions of the arterial wall to changes of internal pressure. The Journal of Physiology. 28 (3), 220-231 (1902).
- Montagne, A., et al. Blood-brain barrier breakdown in the aging human hippocampus. Neuron. 85 (2), 296-302 (2015).
- Zhang, X., et al. Circulating heparin oligosaccharides rapidly target the hippocampus in sepsis, potentially impacting cognitive functions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (19), 9208-9213 (2019).
- Kim, K. J., Filosa, J. A. Advanced in vitro approach to study neurovascular coupling mechanisms in the brain microcirculation. The Journal of Physiology. 590 (7), 1757-1770 (2012).
